稻瘟病菌两阶段产孢实用指南：滤纸法的建立及其对不同寄主来源菌株的适用性评价

《Plant Methods》：A practical guide to two-stage sporulation of Pyricularia oryzae: introducing a filter paper method and comparison with existing methods using strains from diverse grass hosts

本研究针对稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）不同寄主来源菌株产孢能力差异大、现有方法适配性不足的问题，系统比较了五种两阶段产孢方法。新开发的滤纸法在78%的菌株中达到接种浓度阈值（≥5×104spores/mL），且冻存孢子活性稳定，为病原性检测和抗病育种提供了标准化接种体制备方案。

　　

稻瘟病是全球粮食安全的重大威胁，其病原真菌稻瘟病菌（Pyricularia oryzae，曾用名Magnaporthe oryzae）不仅危害水稻，还侵染小麦、燕麦、黑麦草等十余种禾本科作物。然而，这一病原菌在人工培养基上产孢能力不稳定，且现有产孢方法多针对水稻源菌株优化，对日益增多的非水稻寄主源菌株适用性未知。更棘手的是，传统单阶段培养产生的孢子成熟度不均，而复杂的两阶段方法又存在操作繁琐、冻存困难等问题，严重制约了病原性鉴定和抗病育种的效率。

为解决上述问题，日本农业食品产业技术综合研究机构（NARO）等团队在《Plant Methods》发表研究，系统比较了五种两阶段产孢方法（包括新开发的滤纸法）对23株不同禾本科寄主来源菌株的适用性，并评估了孢子冻存后的活性与致病性。研究通过核糖体DNA（rDNA）系统发育分析明确菌株分类，采用标准化培养环境控制变量，通过孢子计数、萌发实验和离体叶片接种测定，综合评价各方法的实用性。

关键方法概述

研究以23株来自水稻、小麦、黑麦草等13种禾本科植物的Pyricularia菌株为样本，涵盖Oryza、Setaria、Lolium等5个系统发育谱系。比较的五种方法包括：滤纸法（本研究建立）、IRRI法（国际水稻研究所）、菌丝垫法、玉米粒法和TARI法（台湾农业研究所）。所有方法均分为预培养、营养生长和产孢三个阶段，第二阶段统一在25°C、黑光灯连续照射的湿润环境中进行。孢子浓度通过血球计数板测定，致病性采用叶片贴片法评价，孢子冻存活性通过40°C干燥和-40°C保存6个月后检测。

结果

菌株系统发育背景与产孢效率差异

rDNA序列分析将21株菌归入P. oryzaeclade，并划分为Eleusine、Setaria、Oryza等5个谱系，2株Digitaria ciliaris源菌株属P. grisea。产孢效率呈现显著的菌株特异性，与谱系无明确关联。例如同属Lolium谱系的p1和p4菌株产孢量差异显著，而水稻源菌株p4t在所有方法中均未能达到接种浓度阈值（5×10⁴spores/mL）。

滤纸法展现最广适用性

滤纸法在78.3%（18/23）的菌株中达到接种浓度阈值，显著优于菌丝垫法（13.0%），且与TARI法（69.6%）、IRRI法（65.2%）和玉米粒法（60.9%）无统计差异。Setaria谱系菌株整体产孢量较高，但滤纸法在低产孢菌株（如p29）中仍表现稳定。

孢子活性与致病性高度一致

所有方法产生的孢子萌发率均超过99%，冻存6个月后仍保持活性。以黑麦草源菌株p1接种4种植物发现，其仅对黑麦草（病害等级9）和小麦（等级7）表现强致病性，而对水稻（等级1）和玉米（等级0）几乎无侵染。不同方法所产孢子引起的病斑面积和病害等级无显著差异，证实产孢方法不影响孢子毒性。

讨论与结论

研究首次系统验证了两阶段产孢方法对非水稻寄主源稻瘟病菌的适用性。滤纸法通过将菌丝浸渍于滤纸并直接干燥冻存，简化了孢子收集步骤，避免了有机溶剂提取的风险，且成本仅为菌丝垫法的46%。该方法尤其适合需长期保存接种体的抗病育种项目，而玉米粒法则因成本最低（0.1143美元/皿）更适用于大规模接种。研究同时指出，产孢效率受营养抑制效应和转接时间影响，未来可通过优化培养基碳氮比进一步提升低产孢菌株的适应性。

本工作为全球稻瘟病流行区实验室提供了可灵活选择的产孢方案，尤其为应对气候变化下病原菌寄主范围扩张的防控策略奠定了技术基础。