综述：NETosis特异性细胞死亡：痛风性关节炎发病机制中的新机制

《European Journal of Medical Research》：NETosis-specific cell death: a novel mechanism in the pathogenesis of gouty arthritis

本综述系统阐述了中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在痛风性关节炎（GA）中的双重作用。文章详细解析了NETs的结构、NETosis的形成过程及其在GA中的潜在调控机制（如NADPH/ROS、炎症小体和自噬通路），并探讨了NETs通过形成聚集体（AggNETs）降解尿酸钠（MSU）晶体缓解炎症，或通过激活巨噬细胞等途径加剧组织损伤的矛盾角色。最后，综述总结了靶向NETs的潜在治疗策略（如NETosis抑制剂、DNase）及其局限性，为GA的防治提供了新视角。

　　

引言

痛风性关节炎（Gouty Arthritis, GA）是一种由尿酸钠（Monosodium Urate, MSU）晶体在关节内沉积引发的免疫介导的炎症性疾病。随着生活水平的提高和生活方式的改变，GA呈现出高发病率、低治愈率和多种并发症的特点。目前其病理生理机制尚未完全阐明，因此寻找有效的治疗靶点至关重要。中性粒细胞作为先天免疫的主要效应细胞，在GA的炎症反应中扮演了核心角色。中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）是由DNA、组蛋白和多种颗粒蛋白（如中性粒细胞弹性蛋白酶NE、髓过氧化物酶MPO、肽基精氨酸脱亚胺酶4 PAD4）组成的复杂网状结构，其形成过程被称为NETosis，是中性粒细胞特有的一种程序性细胞死亡模式。近年来，NETs作为GA的潜在治疗靶点受到了广泛关注。

NETs的结构与形成过程

NETs的结构骨架是去浓缩的染色质DNA，上面装饰着组蛋白（H2A, H2B, H3, H4）以及来自中性粒细胞颗粒的多种酶，如NE、MPO和PAD4。这些组分协同作用，共同构成了一个捕获并杀灭病原体的物理和化学屏障。细胞外DNA通过螯合阳离子和破坏细菌膜完整性来发挥抗菌作用。组蛋白则通过其带正电的氨基酸与带负电的微生物膜发生静电相互作用，破坏膜稳定性。MPO与NETs上的DNA结合，产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）、次氯酸等氧化性物质，创造不利于病原体生存的环境。NE在NETosis过程中通过切割组蛋白来加速染色质的去浓缩。PAD4则将组蛋白H3上的精氨酸残基转化为瓜氨酸，改变其电荷和结构，从而促进染色质解聚和NETs的形成与稳定。值得注意的是，NETs的关键组分在疾病中扮演着双重角色。一方面，它们可作为损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs），激活免疫细胞并诱导促炎因子释放，导致组织损伤；另一方面，在高密度NETs下，NE等丝氨酸蛋白酶能降解TNF-α、IL-6等炎性因子，从而促进炎症的消退。

NETosis的形成主要有两条途径：自杀性NETosis和存活性NETosis。自杀性NETosis，也称为裂解性NETosis，是一种独特的程序性细胞死亡形式。它主要依赖于NADPH氧化酶。上游信号通路（如Ras-Raf-MEK-ERK和DAG-PKC）激活NADPH氧化酶，导致ROS大量生成。这些活性氧促进MPO和NE的释放，从而驱动NETosis。此外，炎症小体通路（包括caspase-1介导的经典通路和caspase-11介导的非经典通路）、mTOR信号通路以及钙离子内流激活PAD4等机制，均可诱导自杀性NETosis。

存活性NETosis则不同，它不导致中性粒细胞死亡。在金黄色葡萄球菌或白色念珠菌等刺激下，中性粒细胞发生核存活性NETosis，核染色质被包裹在囊泡中，从核膜出芽，穿越细胞质并与质膜融合，最终将染色质释放到细胞外空间形成NETs。此外，线粒体DNA（mtDNA）也能被纳入NETs。在诱导线粒体损伤的刺激下，线粒体转移到细胞表面，释放氧化的mtDNA到细胞外形成NETs，这一过程被称为线粒体存活性NETosis。

GA中NETosis的潜在机制

在GA中，MSU晶体作为DAMP，通过多种潜在机制介导NETosis。

NADPH氧化酶和ROS通路是NET形成的主要途径。MSU晶体通过P2Y受体（P2YRs）调节NADPH氧化酶的上游Raf/MEK/ERK通路，激活NADPH氧化酶，上调抗凋亡蛋白，促使中性粒细胞从凋亡转向NETosis。ROS可刺激NE和MPO从嗜天青颗粒中释放并转位至细胞核，引起染色质去浓缩，最终导致核膜破裂和染色质释放。此外，NADPH介导的NETosis可与坏死相互作用，ROS调节下游RIPK3/MLKL通路（坏死的核心调控通路），加速NETosis过程。但也有研究表明，可溶性尿酸或MSU晶体可通过激活NF-κB或MAPK/Akt通路，以不依赖于ROS的方式诱导NETosis，这表明MSU诱导的NETosis可能是多种先天免疫信号网络相互作用的结果。

炎症小体通路在GA中也至关重要。MSU晶体可通过组装NLRP3炎症小体激活caspase-1介导的经典炎症小体通路。活化的caspase-1切割GSDMD产生其N端片段（GSDMD-N），GSDMD-N在细胞膜和核膜上打孔，导致膜穿孔、染色质去浓缩和细胞内容物释放，加速NETosis。MSU晶体也能通过Toll样受体4（TLR4）激活非经典炎症小体通路，释放活化的caspase-11（p26），进而水解GSDMD诱导NETosis。GSDMD-N还能穿孔线粒体膜，增加线粒体ROS和mtDNA的释放，可能有助于存活性NETosis。

自噬也与NETosis密切相关。在GA中，自噬诱导的NETosis受到mTOR的调控。MSU晶体可增加中性粒细胞中NFIL3的表达，促进REDD1的转录，从而抑制mTOR信号轴，上调自噬相关标志物LC3-II和ATG7。ATG7可与p53协同进入细胞核，促进PAD4的表达，进而诱导NETosis。抑制PI3K/AKT/mTOR通路可促进自噬并缓解GA，而删除该通路的负调控因子PTEN则会抑制自噬并减少NETosis。

NETs在GA中的作用

NETs在GA中扮演着双重角色，如同一把双刃剑。

一方面，NETs可以聚集体（AggNETs）的形式缓解GA。GA是一种自限性疾病，其症状常在急性发作后数天或数周内自行缓解。在这个过程中，大量中性粒细胞被招募到关节损伤部位，在MSU晶体刺激下释放NETs，这些NETs聚集形成结构更致密的AggNETs。AggNETs能够有效地捕获并降解MSU晶体。同时，在中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs，如NE、PR3）的协助下，AggNETs还能降解和中和一系列炎症因子和趋化因子，发挥抗炎作用，这很可能参与了GA的自限过程。值得注意的是，虽然AggNETs有助于清除MSU晶体，但过量的AggNETs也可能形成堵塞物，存在阻塞心血管、消化系统和泌尿系统的风险。

另一方面，NETs也能加剧GA的炎症和组织损伤。首先，NETs中的组蛋白和颗粒蛋白可以激活免疫系统，招募单核细胞和巨噬细胞等免疫细胞至炎症部位，并分泌IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子，加剧炎症反应，而这些炎症因子又会进一步促进NETosis，形成恶性循环。NETs中的DNA和其他成分可作为DAMPs直接激活NLRP3炎症小体诱发炎症。例如，NETs释放的组蛋白可破坏溶酶体膜，直接释放组织蛋白酶到胞质中，这些酶激活NLRP3炎症小体并触发炎症反应。NETs中的颗粒蛋白如PAD4也被证明能增强NLRP3炎症小体的活性。在GA中，NETs可能通过类似机制诱导滑膜纤维化、炎症浸润和增生，加剧滑膜炎和关节炎症。

此外，NETs还能直接造成组织损伤。研究表明，NETs可直接损伤内皮细胞和上皮细胞。GA患者的血清尿酸水平与血管内皮细胞功能障碍密切相关，MSU晶体本身即可损伤血管内皮功能，而NETs可能加剧MSU引起的血管损伤和炎症。GA与肾功能密切相关，NETs在肾小球肾炎等肾脏疾病中可加剧肾上皮细胞损伤，在GA中，MSU诱导的NETs可能损伤肾上皮细胞，影响肾小管尿酸分泌和重吸收的平衡，导致尿酸排泄受损，加重GA症状。NETs中的MPO加速ROS的释放和脂质过氧化物的积累，这不仅加剧炎症和氧化应激，还可导致细胞外基质（ECM）和胶原降解，这与骨关节炎（OA）的发生发展密切相关。虽然GA主要与免疫炎症相关，但MSU晶体的沉积和反复、长期的炎症最终会破坏关节软骨，导致OA。因此，NETs对软骨ECM的潜在损伤值得关注，它可能加速GA中OA的发生。

GA中其他类型的胞外诱捕网（ETs）

除了中性粒细胞，其他免疫细胞如嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和巨噬细胞也能形成胞外诱捕网（ETs）。研究表明，MSU晶体可以诱导嗜酸性粒细胞形成ETs（EETs），而嗜碱性粒细胞则不会通过内化MSU晶体释放ETs。EETs可能像NETs一样，在GA中发挥双重作用。巨噬细胞在GA中扮演着关键而多面的角色，它们既能识别MSU晶体并激活NLRP3炎症小体引发炎症，也能清除MSU晶体和NETs发挥抗炎作用。巨噬细胞胞外诱捕网（METs）的存在增加了巨噬细胞在GA中功能的复杂性。虽然尚无直接证据表明MSU晶体能诱导METs，但体外研究表明LPS或TNF-α刺激可触发巨噬细胞形成METs，提示METs可能存在于GA的炎症微环境中。METs可能类似NETs，既可能促进炎症，也可能形成聚集体帮助清除MSU晶体。

NETs作为GA的潜在治疗靶点

鉴于NETs在GA中的明确作用，靶向NETs已成为GA治疗的一个有前景的策略。靶向NETs的方法主要包括抑制NETosis的形成和促进已形成NETs的降解。

在抑制NETosis方面，一些已用于临床治疗GA的药物可能通过抑制NETosis发挥作用。例如，秋水仙碱可通过抑制NADPH氧化酶依赖性途径，减少ROS生成和钙内流来抑制NETs产生。糖皮质激素也被发现能减少NETs形成。此外，针对NETosis关键分子的抑制剂显示出潜力。PAD4抑制剂（如Cl-amidine、BMS-P5、GSK484）、NE抑制剂（如sivelestat）、NADPH氧化酶抑制剂（如GSK2795039）以及P2Y受体阻滞剂（如MRS2578）均能在不同疾病模型中有效抑制NETs形成。近年来发现的NET抑制肽（NIPs）通过抑制PAD4活性来阻止NETosis，在脓毒症等疾病中显示出强大的抗NET和抗炎特性，具有治疗GA的潜力。一些天然化合物也具有通过靶向NETs治疗GA的潜力，如姜黄素、白藜芦醇、槲皮素和落新妇苷等，它们可通过抑制NADPH氧化酶活性、NLRP3炎症小体激活或P2Y6受体等途径抑制NETosis。针对细胞死亡过程与NETosis相互作用的抑制剂也很有前景，例如抑制GSDMD可干扰NETosis，坏死抑制剂（如Necrostatin-1, Nec-1s）和MLKL抑制剂（如necrosulfonamide）可抑制NETosis，自噬抑制剂羟氯喹（HCQ）也能抑制自噬介导的NETosis。

在促进NETs降解方面，DNase是一种能降解DNA骨架的天然酶，可有效瓦解NETs的网状结构，清除NETs及其相关的微生物，抑制NETs引起的炎症和组织损伤。研究表明，DNase I治疗可通过降解NETs降低血栓形成率，并在慢性血栓栓塞性肺动脉高压模型中减少纤维化。GA患者血清DNase-1活性低，其滑液和滑膜组织中NETs更多且更难清除，提示DNase I治疗GA的潜力。另一种降解NETs的方法是肝素治疗。肝素可通过将组蛋白从胞外诱捕网的染色质支架上分离来破坏NETs的稳定性，从而促进NETs降解。低分子量肝素可减少NETs数量。

然而，靶向NETs治疗GA也存在局限性。首先，抑制NETs形成可能会损害机体捕获和降解病原体的免疫功能，增加对病原体的易感性。其次，NETs降解会导致残留的组蛋白和颗粒蛋白释放，这些是已知的DAMPs，可能引起局部炎症和组织损伤。此外，目前临床还缺乏有效的NETs相关诊断和预后生物标志物。

结论

NETosis是中性粒细胞特有的程序性细胞死亡模式，产生的NETs在GA的免疫和炎症环境中引发多样化的反应。本综述总结了NETs的结构和功能，阐明了MSU晶体调控NETosis的多种机制。值得注意的是，NETosis本身可以与其他细胞死亡方式（如自噬、坏死）相互作用，共同促进NETs的形成。NETs在GA中扮演着双重角色：一方面，它们可以形成AggNETs来清除和降解MSU晶体及炎症因子，缓解GA；另一方面，它们又可通过诱导炎症和造成组织损伤来加剧GA。本文总结了几种有前景的靶向NETs的抑制剂，旨在为GA的预防和治疗提出创新性策略和新方法。未来的研究需要进一步验证NETosis在GA中的具体机制，明确NETs在不同GA阶段的确切作用，并评估靶向NETs治疗策略在GA中的长期疗效和安全性。