RIG-I 在脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）和肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的刺激下，促使神经胶质细胞产生保护性的一型干扰素（interferon type I）

《Frontiers in Immunology》：RIG-I drives protective type I interferon production by glial cells in response to Neisseria meningitidis and Streptococcus pneumoniae challenge

RIG-I通过促进I型干扰素（IFN-β）分泌及下游ISGs表达限制脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌感染，其激动剂可增强胶质细胞保护性免疫反应。

　　细菌性脑膜炎是一种进展迅速且可能致命的中枢神经系统（CNS）感染，其特征是胶质细胞的激活和强烈的神经炎症反应。尽管Toll样受体（TLRs）在CNS免疫中已被广泛研究，但细胞质中的核酸传感器如视黄酸诱导基因I（RIG-I）在细菌性脑膜炎中的作用仍然不明确。RIG-I通常被认为在抗病毒反应中起关键作用，包括I型干扰素（IFN）的产生。然而，越来越多的证据表明RIG-I也可能参与细菌感染的宿主免疫反应。基于此前的研究发现细菌RNA可以激活RIG-I在胶质细胞中的表达，我们旨在进一步探讨RIG-I在细菌性脑膜炎中的功能贡献。

本研究采用了原代小鼠和永生化的人类胶质细胞来分析RIG-I介导的反应在细菌感染中的作用。我们通过免疫印迹分析和特异性捕获ELISA技术来检测RIG-I、I型干扰素刺激基因（ISGs）以及I型IFN的表达变化。为了评估RIG-I在细菌感染中的功能，我们利用了siRNA介导的RIG-I沉默和RIG-I及其下游信号通路的药理学抑制。研究结果表明，RIG-I在人类和小鼠的胶质细胞中具有基础表达，并且在细菌感染后其蛋白水平会进一步升高，这种变化取决于感染的细菌种类和胶质细胞亚型。此外，我们发现RIG-I在细菌感染中能够促进保护性的I型IFN反应，从而限制细菌在胶质细胞中的存活。同时，我们的研究还指出I型IFN信号通路通过IFNAR和ISGs的诱导对于限制细菌在胶质细胞中的生存至关重要。令人振奋的是，我们还发现通过使用RIG-I核酸激动剂可以增强这些保护性反应，为细菌性脑膜炎的治疗提供了新的思路。

在实验方法部分，我们首先介绍了人类胶质细胞系的来源和培养条件。这些细胞系来源于小鼠的原代细胞，并通过慢病毒载体编码SV40 T抗原和人端粒酶逆转录酶进行转化。细胞在含有5%胎牛血清（FBS）和100 U/ml青霉素-100 μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，并在37°C和5% CO?的环境下维持。接着，我们描述了原代小鼠胶质细胞的分离和培养过程。这些细胞通过特定的培养方法进行分离，并在含有10% FBS和青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中培养两周。为了分离小鼠的星形胶质细胞，我们使用了0.25%胰蛋白酶和1 mM EDTA处理混合胶质细胞，并在含有10% FBS和青霉素-链霉素的RPMI 1640中维持。小鼠的微胶质细胞则在含有10% FBS和20%来自LADMAC细胞（ATCC，Cat #CRL-2550）的条件培养基中培养，该条件培养基分泌集落刺激因子1（CSF-1），对微胶质细胞的存活至关重要。

在细菌培养部分，我们使用了Neisseria meningitidis MC58菌株（ATCC BAA-335）和Streptococcus pneumoniae CS109菌株（ATCC 51915），并在含5%脱纤维羊血的哥伦比亚琼脂平板上进行培养，随后在哥伦比亚肉汤中培养。为了确定细菌数量，我们使用了Genespec3分光光度计进行菌落形成单位（CFUs）的测定。接下来，我们描述了胶质细胞感染细菌的具体操作。将胶质细胞以每孔5×10?个的密度接种，并在无抗生素的培养基中感染N. meningitidis或S. pneumoniae，MOI分别为50:1、75:1或100:1。感染后，将培养基更换为含有1%青霉素-链霉素的新鲜培养基，并在指定时间点收集细胞上清液和全细胞蛋白裂解液进行分析。

为了研究RIG-I在细菌感染中的作用，我们采用了siRNA技术进行RIG-I的沉默。使用Silencer Select siRNA（Thermo Fisher Scientific）进行转染，浓度分别为5nM（人类微胶质细胞）和10nM（小鼠微胶质细胞和星形胶质细胞）。转染后24小时，将细胞感染N. meningitidis或S. pneumoniae。收集细胞上清液和全细胞蛋白裂解液，并进行免疫印迹分析和特异性捕获ELISA检测IL-6和IFN-β的水平。我们还使用了BX795（TBK1/IKKε抑制剂）和Fludarabine（STAT1抑制剂）进行药理学干预，以评估RIG-I下游信号通路在保护性反应中的作用。通过这些方法，我们能够确定RIG-I在细菌感染中是否能够驱动I型IFN的产生以及ISGs的表达。

研究结果部分显示，RIG-I在感染N. meningitidis和S. pneumoniae后，其蛋白水平在不同的胶质细胞亚型中显著增加。在小鼠的星形胶质细胞和微胶质细胞中，RIG-I的表达水平在感染后24小时达到高峰，而在人类微胶质细胞中则有所降低。同时，感染导致IL-6和IFN-β的显著增加，其中IFN-β的释放在感染后24小时才明显升高，这表明RIG-I介导的I型IFN反应具有延迟性。进一步的实验表明，RIG-I的沉默显著降低了IL-6和IFN-β的产生，同时增加了细菌的存活率，这表明RIG-I在细菌感染中起着关键的保护作用。此外，我们发现通过IFN-β的外源性治疗，能够显著增强胶质细胞的抗微生物反应，从而减少N. meningitidis和S. pneumoniae的存活率。在IFNAR信号通路被抑制的情况下，细菌的存活率显著上升，这表明I型IFN的信号传导对于限制细菌感染至关重要。

在进一步的研究中，我们使用了已知的RIG-I激动剂，如B-DNA、polyI:C和5’-三磷酸双链RNA（5’ppp dsRNA）来激活胶质细胞中的RIG-I。结果表明，这些激动剂能够显著刺激胶质细胞产生IL-6和IFN-β，并减少细菌的存活率。值得注意的是，LPS虽然能够激活TLRs，但并未显著减少细菌的存活率，这可能表明RIG-I在抗细菌反应中具有独特的功能。同时，我们还观察到在人类微胶质细胞中，RIG-I的激活同样能够促进ISGs的表达，进一步支持其在抗细菌免疫中的作用。

讨论部分强调了RIG-I在CNS免疫中的重要性。细菌性脑膜炎的严重性部分源于CNS内的过度炎症反应，而胶质细胞通过表达和产生模式识别受体（PRRs）在识别和响应入侵病原体中发挥关键作用。我们的研究发现，RIG-I在感染N. meningitidis时表现出显著的蛋白上调，而在感染S. pneumoniae时则无明显变化，这表明RIG-I的反应具有病原体特异性。这种特异性可能与细菌表面的粘附因子和内部化机制有关。此外，我们还发现RIG-I介导的I型IFN反应能够有效限制细菌在胶质细胞中的生存，这一过程依赖于IFNAR的信号传导和ISGs的表达。通过使用RIG-I激动剂，我们能够增强胶质细胞的保护性反应，这为细菌性脑膜炎的治疗提供了新的方向。这些结果表明，RIG-I不仅在抗病毒免疫中起重要作用，也在抗细菌免疫中具有关键的调节功能。未来的研究应进一步探索RIG-I驱动的信号通路，并开发针对RIG-I的激动剂，以提高CNS感染的宿主防御能力。