乳酸可以降低代谢产生的热量，增强琥珀酸的代谢，并提高酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）对热应激的耐受性

《Biochemistry and Cell Biology》：Lactate reduces metabolic heat, enhances succinate metabolism, and improves thermal stress tolerance in Saccharomyces cerevisiae

乳酸通过增强线粒体复合体II活性降低酵母产热比并提升热耐受性，揭示其代谢调控新机制。

　　近年来，乳酸在生物体内的作用逐渐从单纯的代谢副产物转变为关键的调节因子，这一转变揭示了其在维持细胞稳态和应对环境压力中的重要性。乳酸浓度的升高通常与多种生理应激反应相关，表明它可能在调控细胞代谢和热平衡中扮演着不可或缺的角色。尽管已有研究表明乳酸可能抑制哺乳动物细胞内的内在代谢产热，但其作用机制以及对细胞热应激反应的具体影响仍不明确。本研究通过使用面包酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）这一模式生物，进一步拓展了乳酸介导热抑制效应的研究范围，同时将这一现象与线粒体复合体II（即琥珀酸脱氢酶）活性的增加联系起来，并展示了乳酸对热诱导细胞死亡的显著减少。这些发现不仅支持了乳酸在代谢调控和热保护方面的新视角，还为理解其在细胞层面的作用机制提供了新的线索。

在真核细胞中，大多数能量来源于有氧呼吸过程。这一过程涉及将来自宏量营养物（如碳水化合物）的底物通过线粒体三羧酸循环（TCA）和电子传递链进行氧化，氧气（O?）作为最终的电子受体。该过程具有高度的放热性，反映了整体反应的热力学优势。然而，由此产生的代谢热也可能导致细胞过热（即高热状态），尤其是在代谢活动增强或环境温度升高的情况下。高热状态可能干扰正常的生物功能，导致从轻微功能障碍到细胞死亡的多种后果。因此，细胞在应对高热状态时的调控能力是其生理韧性的重要组成部分。

传统上，细胞应激反应的研究主要集中在“损伤修复”策略上，例如热休克蛋白的诱导、DNA/RNA修复通路的激活以及其他保护细胞结构和功能生物分子的机制。相比之下，基于代谢燃料的急性热缓解现象在非哺乳动物中仍缺乏明确的定义。代谢热通常通过“热呼吸比”（calorespirometric ratio, CRR）进行衡量，即单位氧气消耗所产生的热量。Thornton规则描述了有机化合物燃烧过程中热呼吸比的近似不变性，为有氧呼吸细胞设定了一个理论最小值，约为430–480 kJ/mol O?。虽然一些研究支持这一数值在分解代谢稳态下的适用性，但也有研究质疑其在生物系统中的普遍性。

历史上，乳酸被认为是一种代谢“死端”，主要用于发酵过程中丙酮酸的还原，以再生NAD?。然而，越来越多的证据表明，乳酸不仅是一种代谢燃料，还在细胞信号传导和应激反应中发挥关键作用。早期的研究显示，在乳酸喂养的酵母中观察到的热呼吸比降低，可能归因于内耗性合成活动或发酵，而非改变产热输出。近期的研究则指出，在乳酸喂养的渗透化哺乳动物脑组织中，热呼吸比低于300 kJ/mol O?，远低于Thornton规则预测的数值。这一发现引发了乳酸可能主动影响真核细胞能量代谢热预算的假设。然而，乳酸如何抑制细胞热呼吸比的具体机制仍然不清楚。

本研究通过使用面包酵母，旨在填补乳酸对代谢热影响的科学空白。观察到的乳酸依赖性热呼吸比降低并非由于细胞从有氧呼吸转向无氧代谢，而是与线粒体复合体II（琥珀酸脱氢酶）活性的增加相关。这一变化伴随着热耐受性的增强。综上所述，这些结果表明乳酸在细胞层面可能同时调控代谢控制和热释放。

在实验准备阶段，我们使用了活性干酵母（*Saccharomyces cerevisiae*; Fleischmann’s），并从本地连锁杂货店采购。Fleischmann’s酵母已被证明具有稳定的基线组成，这支持了其在生物研究中的适用性。酵母生长培养基（YGM）的制备遵循Dejean等人的方法。在实验前，酵母在YGM中进行再水化。更多细节请参见补充材料。

为了测量代谢热和氧气消耗率，我们进行了以下实验。酵母（2 mg/mL，约6×10?个细胞/mL）在含有4 mM所需底物（丙酮酸或乳酸）的YGM中孵育60分钟。之后，将样本分为两部分，分别用于平行测量代谢热和氧气消耗。代谢热的测量采用等温滴定热能法（isothermal titration calorimetry, ITC；Model 4200 Calorimeter, Calorimetry Sciences Corporation）。将1 mL含有所需底物的YGM加载到ITC胶囊中，然后将25 μL分割后的酵母样本注入胶囊中，监测30分钟内的热速率（μJ/s）。

氧气消耗的测量采用Oxygraph O2k呼吸仪（OROBOROS Instruments）。将50 mL分割后的酵母样本注入每个O2k反应室中，反应室中含有2 mL YGM和与ITC平行的底物。氧气流量（pmol O?/s）按照之前的方法记录。将热速率和氧气流量数据标准化为同一样本/条件下的酵母质量，从而计算热呼吸比（kJ/mol O?）。

为了评估热应激对酵母的影响，我们准备了含有所需分析物的YGM中的酵母（1–2 mg/mL），并在目标温度下孵育30分钟。细胞活力通过使用碘化丙啶或台盼蓝染色溶液（Invitrogen）进行评估，遵循制造商的说明。样本在20倍放大下使用奥林巴斯BX53荧光显微镜或EVOS 3000光学显微镜进行成像。所得图像通过Fiji（ImageJ）进行分析，以量化整体细胞死亡率。

为了评估线粒体复合体II的活性，我们使用MTT法进行检测。在含有4 mM底物和/或抑制剂以及5 mM 1-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-3,5-二苯基四唑（MTT）的YGM中，将酵母加入反应室至最终浓度3.25 mg/mL。复合体II通过还原MTT产生蓝色沉淀，通过在指定温度下使用板读仪（SpectraMax M3或VarioSkan Lux）测量560 nm波长的吸光度来检测。乳酸和丙酮酸喂养的酵母样本在相同条件下进行平行检测。

在统计分析方面，所有数据均以均值±标准差表示。不同组之间的数据差异采用双因素方差分析（two-way ANOVA）后，再使用Fisher's LSD进行多重比较（α水平：0.05）。

在实验结果部分，我们发现，在最佳温度（25–30 °C）下，乳酸喂养的酵母表现出比丙酮酸喂养的酵母更低的热呼吸比，且数值低于Thornton规则预测的理论最小值。与哺乳动物脑组织中的情况不同，丙酮酸和乳酸喂养的酵母之间未观察到显著的单位质量氧气消耗差异（表S2）。这表明，热呼吸比的降低并非由于细胞从依赖氧气的代谢转向不依赖氧气的代谢，而是一个可能的解释，此前在酵母研究中并未被排除。然而，有研究指出，在47 °C时，无论使用丙酮酸还是乳酸作为底物，发酵可能对较低的热呼吸比产生影响。添加复合体III抑制剂Antimycin A将氧气消耗降至接近基线水平（图S3），进一步确认了线粒体呼吸是氧气消耗的主要途径。

我们还发现，乳酸的加入显著提高了线粒体复合体II的活性。相反，二甲基琥珀酸（DMM）——一种特异性抑制复合体II的化合物——对丙酮酸喂养的酵母没有影响，但显著抑制了乳酸喂养样本中的活性。这些结果表明，乳酸可能诱导一种代谢转变，倾向于通过复合体II进行琥珀酸氧化。这种转变伴随着一种温和的保护效应：与丙酮酸相比，暴露于乳酸的酵母在30分钟的热挑战（47 °C）后表现出约20%更高的存活率（图1C）。这种保护效应在存在DMM的情况下被消除，进一步说明了复合体II介导的琥珀酸利用是其作用机制之一。这一结果与之前的研究一致，显示复合体II的抑制会加剧酵母在热休克中的损伤。

乳酸诱导的代谢变化和热耐受性可能涉及多种机制。先前的研究表明，乳酸可以增强酵母细胞的热耐受性，这种效应被归因于活性氧（ROS）的增加，而ROS的增加刺激了热休克基因的表达。其他研究也报告了当乳酸作为燃料来源时，ROS的产生量增加。然而，乳酸对琥珀酸代谢和代谢热输出的调控能力，代表了一种新的热耐受机制。

琥珀酸正在成为一种关键的应激反应调节因子。在高热条件下，复合体II的活性已被观察到增加，并与对多种应激因素和疾病状态的保护作用相关。乳酸通过调控琥珀酸利用和代谢热输出，增强热耐受性的能力，提供了一种新的视角，扩展了其作为保护性代谢调节因子的角色，并为理解其作用机制提供了新的线索。

研究还表明，乳酸的代谢不仅影响能量供应，还可能通过改变细胞内的代谢通路，影响热应激的响应。在有氧呼吸过程中，琥珀酸的氧化是通过复合体II进行的，而复合体II的活性增加可能意味着细胞在高热条件下对能量需求的适应性调整。这种调整可能涉及对代谢热的调控，从而减少细胞在高温下的损伤。此外，乳酸可能通过促进琥珀酸的利用，提高细胞的代谢效率，进而增强其在热应激下的生存能力。

在热应激的背景下，细胞的代谢状态对生存至关重要。乳酸的代谢可能通过影响线粒体的功能，调节细胞内的热产生和消耗。这种调节可能涉及对代谢通路的优化，使细胞在高热条件下仍能维持基本的生理功能。例如，乳酸可能通过促进琥珀酸的氧化，减少代谢热的产生，从而提高细胞的热耐受性。此外，乳酸可能通过影响细胞内的ROS水平，调节热休克基因的表达，进而增强细胞对热应激的适应能力。

综上所述，乳酸的作用机制可能涉及多个层面，包括代谢调控、线粒体功能的改变以及细胞应激反应的优化。这些机制的相互作用可能使乳酸在细胞层面发挥保护作用，特别是在高热条件下。通过进一步研究乳酸对代谢热和细胞存活的影响，我们可以更全面地理解其在生物系统中的作用，为代谢调控和热保护的研究提供新的思路。