基因修饰猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）减毒活疫苗通过调节细胞免疫和体液免疫反应减轻猪呼吸道疾病

《Veterinary Research》：Efficacy of genetically modified Mycoplasma hyopneumoniae strains and their effect on local and cell-mediated immune responses in pigs

本研究针对当前商业猪肺炎支原体（M. hyopneumoniae）疫苗仅能提供部分保护的问题，通过转座子突变技术构建了mnuA和mmsA基因缺失的减毒株，并首次通过气管内单次接种评估其免疫保护效果。研究发现△mnuA突变株能显著降低攻毒后咳嗽评分和攻毒株DNA载量，诱导更强的局部IgG和IgA应答，并减少促炎细胞因子产生，表明mnuA基因突变株有望成为新型减毒活疫苗候选株，为控制猪地方性肺炎提供了新策略。

　　

在集约化养猪业中，猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）引发的猪地方性肺炎（Enzootic Pneumonia, EP）是导致经济效益损失的主要呼吸道疾病。当前广泛应用的商业疫苗多为基于1963年分离J株的灭活疫苗，虽然能一定程度减轻临床症状和肺部病变，但仅能提供部分保护，无法完全阻止病原体定植和传播。更值得关注的是，传统灭活疫苗主要通过肌肉注射接种，难以有效诱导黏膜免疫应答，而黏膜免疫对于防御呼吸道病原体入侵具有关键作用。因此，开发能诱导更强免疫保护的新型疫苗成为当前猪肺炎支原体防控的重要研究方向。

减毒活疫苗因其能模拟自然感染过程，诱导更全面的免疫应答而备受关注。然而，目前全球仅有两种减毒活疫苗获得许可（中国和墨西哥），且其保护效果仍有提升空间。理想的新型疫苗应基于当前流行的强毒株构建，而非经过长期体外传代致弱的传统菌株，以更好地匹配田间流行株的抗原特性。

在这项发表于《Veterinary Research》的研究中，Beuckelaere等人通过对高毒力猪肺炎支原体F7.2C株进行基因工程改造，构建了两种减毒突变株：△mmsA（甲基丙二酸半醛脱氢酶基因缺失）和△mnuA（膜核酸酶A基因缺失）。研究人员假设这些关键基因的缺失会减弱菌株的毒力但保留其免疫原性，从而成为有前景的疫苗候选株。他们通过气管内单次接种这些突变株，系统评估了其对猪肺炎支原体攻毒的保护效果及相关免疫机制。

研究团队采用了几项关键技术方法：通过转座子突变技术构建基因缺失株；使用ATP依赖性发光法和颜色改变单位法（CCU）评估菌株生长特性；建立三重数字PCR（dPCR）方法区分和定量疫苗株与攻毒株的DNA载量；通过多因子免疫分析、酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术全面评估体液免疫和细胞免疫应答；采用实验性攻毒模型评估疫苗保护效果。

生长动力学显示突变株与野生型F7.2C存在差异

通过比较野生型F7.2C株与两种突变株的生长曲线，研究人员发现△mmsA和△mnuA突变株的生长特性发生了改变。野生型菌株在培养5天后达到ATP峰值（940±65 pmol ATP/mL），而△mmsA和△mnuA分别需要6-7天和6-8天才能达到峰值，且峰值浓度较低。特别值得注意的是，△mmsA突变株的CCU浓度（1.58×10² CCU/mL）远低于△mnuA突变株（1.58×10⁶ CCU/mL），表明mmsA基因缺失对菌株体外生长能力影响更大。

△mnuA减少攻毒后咳嗽并降低BAL中M. hyopneumoniae DNA载量

临床观察结果显示，接种△mnuA的猪只在疫苗接种后出现轻微咳嗽，但在攻毒后咳嗽评分显著低于△mmsA和对照组。更重要的是，通过特异性三重dPCR检测发现，攻毒后两周和四周，△mnuA组支气管肺泡灌洗液（BAL）中攻毒株DNA拷贝数显著低于其他两组。攻毒后四周，△mnuA组平均攻毒株DNA载量（0.69 Log₁₀ copies/μL）比△mmsA组（2.95 Log₁₀ copies/μL）和对照组（4.19 Log₁₀ copies/μL）低2.3-3.5个对数单位，且△mnuA组12只动物中有7只在两个采样时间点均未检测到攻毒株DNA。

M. hyopneumoniae特异性抗体反应在接种动物血清和BAL中被诱导

血清学分析显示，接种后四周，△mnuA组多数动物已发生血清转化，而△mmsA组动物仍为血清阴性。攻毒后两周，两个疫苗接种组血清抗体水平均显著高于对照组。局部抗体应答分析发现，攻毒后△mnuA组BAL中IgG和IgA水平显著高于对照组，而△mmsA组仅在安乐死时BAL IgA水平显著高于对照组。这表明△mnuA突变株能诱导更强的全身和黏膜抗体应答。

接种动物攻毒后产生较少的局部促炎细胞因子

细胞因子检测结果显示，攻毒后四周，两个疫苗接种组BAL中促炎细胞因子IL-1β和IL-6浓度显著低于对照组，而IFN-γ、IL-10和IL-17A浓度在各组间无显著差异。这表明疫苗接种减轻了攻毒引起的炎症反应，可能有助于减少肺部病理损伤。

疫苗接种和攻毒后CD8⁺ T细胞细胞因子产生发生改变

流式细胞术分析显示，疫苗接种后四周，△mnuA组血液中IFN-γ⁺和TNF-α⁺IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞比例显著低于对照组，而IL-17A⁺ CD8⁺ T细胞比例显著高于△mmsA组。攻毒后，△mmsA组IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞比例显著低于对照组。这表明不同突变株对T细胞免疫应答的调节作用存在差异。

研究结论表明，气管内单次接种△mnuA突变株能显著降低攻毒后临床症状和肺炎支原体载量，诱导较强的全身和黏膜抗体应答，并调节细胞免疫反应。尽管△mnuA接种后引起短暂咳嗽，但其保护效果显著，mnuA基因突变株是具有潜力的减毒活疫苗候选株。相比之下，△mmsA突变株可能因过度致弱而无法在肺部有效定植，保护效果有限。

该研究的创新点在于首次构建了基于当前流行强毒株的基因工程减毒株，并通过黏膜接种途径评估其免疫保护效果。研究发现不仅为猪肺炎支原体疫苗研发提供了新候选株，也为理解减毒活疫苗的免疫保护机制提供了重要见解。特别是△mnuA突变株能显著降低攻毒株载量的特点，提示其可能具有抑制病原体定植和传播的潜力，这对于控制猪场中肺炎支原体的传播具有重要意义。然而，作者也指出需要进一步研究优化接种方案、评估安全性和验证田间效果，以推动其实际应用。