西藏圆环病毒在猪体内的元病毒组鉴定及其致病性评估

《Transboundary and Emerging Diseases》：Metavirome Identification and Pathogenicity Evaluation of Tibet Orbivirus in Pigs

西藏 orbivirus (TIBOV) 在猪中的遗传特征和致病性评估。通过病毒基因组测序和动物实验，发现TIBOV在感染猪体内长期存在（21天），主要病理损伤集中在脾脏，伴随轻微临床症状如蹄部出血。免疫分析显示病毒早期抑制宿主免疫应答，如降低IL-18、TNF-α和干扰素水平。研究揭示了TIBOV在猪中的潜在传播风险和脾脏作为主要靶器官的特性。

　　Tibet orbivirus (TIBOV) 是一种属于 Orbivirus 属的病毒，该属是 Reoviridae 家族的一部分。虽然 TIBOV 通常由蚊子和 Culicoides 传播，但在猪体内已检测到特定的中和抗体，但目前尚不清楚 TIBOV 在猪体内感染的分子遗传特征及其对仔猪的致病性。本研究旨在探讨 TIBOV 在感染猪中的遗传特征，并评估其对仔猪的致病性。通过病毒宏基因组测序，从猪组织中获得了 TIBOV 的七个基因片段（VP1-VP4、VP6、NS1 和 NS2），这些序列与从 Culicoides、蚊子和牛中分离出的 TIBOV 样本具有高度同源性。感染 TIBOV 后，仔猪的体温、食欲和行为正常，但所有仔猪的蹄部均出现出血结节，其中一只仔猪的腹部皮肤也出现了出血结节。病毒血症在感染后第 2 天首次被检测到，在第 6 天达到高峰，并在第 21 天仍保持较高水平。病毒在多个器官中分布，其中脾脏中病毒载量最高，病毒核酸信号最强。脾脏是最严重的病变部位，白髓萎缩、淋巴细胞数量减少和髓索隔膜变宽，表明脾脏是 TIBOV 感染的主要靶器官。在第 2 到第 6 天感染后，包括 IL-18、TNF-α、IFN-α 和 IFN-λ3 在内的多种炎症细胞因子在血液淋巴细胞中的水平显著下降，而 ISG-15 和 IRF-7 的表达水平在第 2 到第 9 天也显著下降，这表明在感染初期，宿主免疫反应受到抑制。研究结果证实了 TIBOV 在仔猪中引发长期病毒血症并伴有轻微临床症状，脾脏是 TIBOV 增殖的主要靶器官，而宿主免疫反应可能在病毒感染初期被轻微抑制。

TIBOV 的基因组由 10 个双链 RNA（dsRNA）片段组成，每个片段的核苷酸序列长度从 3950 bp（Seg 1）到 832 bp（Seg 10）。所有片段都具有相同的结构，包括 5' 非翻译区（UTR）、编码序列（CDS）和 3' UTR，并编码三个非结构蛋白（NS1–3）和七个结构蛋白（VP1–7）。病毒衣壳由外衣壳蛋白、中间衣壳蛋白和内衣壳蛋白组成。与其他 orbivirus（如蓝舌病毒 [BTV] 和出血热病毒 [EHDV]）的同源蛋白相似，TIBOV 的外衣壳蛋白 VP2 高度可变，TIBOV 株可以根据 VP2 蛋白的多样性分为六个血清型（TIBOV-1 到 TIBOV-6）。TIBOV-1、-2、-5 和 -6 从中国分离，而 TIBOV-4 和 -5 则从日本分离。这些发现表明，TIBOV 在亚洲广泛分布，并且在动物体内可能具有多种血清型。

在本研究中，通过对从云南不同地点采集的猪组织样本进行宏基因组测序，研究人员发现这些样本中存在多个 TIBOV 基因片段。其中，从 2023 年 10 月 16 日采集的三个样本中，均检测到了 TIBOV 的基因序列。然而，在 2023 年 12 月 15 日采集的样本中未检测到 TIBOV 的序列。这些基因片段的长度从 500 到 1263 bp 不等，并且与参考 TIBOV 株的相应片段具有高度同源性（95.01%–99.70%）。这些结果表明，TIBOV 在猪体内存在，并且与从其他宿主中分离出的 TIBOV 株具有密切关系。此外，通过系统发育分析，研究人员发现这些 TIBOV 株的序列并未形成单独的分支，而是与参考株聚集在一起，进一步表明 TIBOV 在不同宿主中的传播和演化可能具有一定的连续性。

为了评估 TIBOV 对猪的致病性，研究人员选择了 28 天龄的仔猪进行实验感染。在感染期间，所有被感染的仔猪均未死亡，且没有明显的发热、呼吸症状、食欲减退或腹泻等临床症状。然而，在感染后的第 7 到 11 天，所有仔猪的蹄部均出现出血结节，其中一只仔猪的腹部皮肤也出现了出血结节。这些出血结节在第 13 到 16 天消失。此外，仔猪 T1 在第 7 到 9 天表现出活动减少，倾向于卧床。随着感染时间的推移，其活动逐渐恢复，表明 TIBOV 在仔猪中表现出轻微的致病性。

病毒血症的检测显示，TIBOV 在感染后第 2 天首次被检测到，第 6 天达到峰值，并在第 21 天仍然保持较高水平。病毒在多个器官中分布，其中脾脏的病毒载量最高，且病毒核酸信号最强。这表明脾脏是 TIBOV 增殖的主要靶器官。同时，研究还发现，感染仔猪的血液中，IL-18、TNF-α、IFN-α 和 IFN-λ3 的水平在感染初期显著下降，而 ISG-15 和 IRF-7 的表达水平在第 2 到第 9 天也显著下降，表明宿主的免疫反应可能在感染初期受到抑制。这些发现为 TIBOV 在猪体内的感染机制提供了重要的线索。

为了进一步分析 TIBOV 的致病性，研究人员使用了多种方法，包括病毒血症监测、组织病毒载量检测、中和抗体（nAb）水平测定以及炎症细胞因子的表达水平分析。病毒血症的持续时间表明，TIBOV 在猪体内可以引发长期的病毒血症。同时，病毒在多个器官中增殖，其中脾脏的病毒载量最高，这可能与其作为主要靶器官有关。此外，通过 TSA-FISH 技术检测，研究人员发现 TIBOV 的核酸信号在脾脏的红髓中最强，而在大脑中最弱。这表明 TIBOV 在猪体内的分布具有一定的器官特异性。

在感染仔猪后，研究人员还检测了其血液中多种炎症细胞因子的表达水平。结果显示，IL-1β 和 IL-6 的表达水平在感染后显著升高，而 IL-18、TNF-α、IFN-α 和 IFN-λ3 的水平则显著下降。这些变化表明，TIBOV 感染可能对仔猪的免疫系统产生一定的影响，尤其是在感染初期。同时，通过 ELISA 检测，研究人员发现感染仔猪的血清中这些细胞因子的浓度也有所变化，进一步支持了 TIBOV 对宿主免疫反应的潜在影响。

综上所述，TIBOV 在猪体内感染后可能引发轻微的临床症状，如蹄部和腹部皮肤的出血结节，但未表现出严重的致病性。病毒在多个器官中增殖，其中脾脏是主要靶器官，这可能与其免疫系统的相互作用有关。同时，病毒感染可能抑制宿主的免疫反应，尤其是在感染初期。这些发现不仅有助于理解 TIBOV 在猪体内的传播和致病机制，还为未来的防控措施提供了理论依据。此外，由于 TIBOV 在猪体内可能作为长期的病毒库，其在自然界中的传播循环也可能受到影响，因此需要进一步研究其在猪体内的免疫逃逸机制和与其他病原体的相互作用。