高传代次减毒Getah病毒株的衰减特性及其分子特征分析

《Transboundary and Emerging Diseases》：Attenuation Profile and Molecular Characterization of a High-Passaged Attenuated Getah Virus Strain

登革病毒（GETV）HuN1减毒株（HuN1-P230）经230代细胞传代后，其表型与基因型特征表明该株在细胞培养中复制动力学增强，但形成小病灶，且对妊娠小鼠无致病性，100%存活新生儿，并完全保护小鼠免受原始毒株（HuN1）攻击。基因组分析发现26处核苷酸突变（15处氨基酸替换），其中E2蛋白表面关键位点的突变可能通过改变抗原表位实现免疫逃逸。结构分析显示突变集中在E2蛋白的受体结合域和E1蛋白的跨膜区。该研究为GETV减毒疫苗开发提供了分子机制依据。

　　近年来，由Getah病毒（GETV）引发的动物疫情在中国范围内显著上升，这一现象不仅对动物健康构成严重威胁，也对公共卫生带来了潜在风险。GETV是一种通过节肢动物传播的病毒，具有广泛的宿主范围，可感染包括马、猪、牛、狐狸和人类在内的多种哺乳动物。在猪群中，GETV感染常表现为发热、食欲减退、共济失调、震颤以及较高的死亡率；而在怀孕母猪中，感染可能导致流产、死胎、胎儿木乃伊化以及不规则的发情周期等严重繁殖问题。对于马而言，临床症状包括发热、皮疹和后肢水肿；而在狐狸中，感染则可能引发高热、食欲丧失、神经系统异常以及高死亡率。GETV的传播范围和感染症状的多样性使其成为一种重要的动物病原体，尤其是在中国，其疫情的上升趋势进一步凸显了其对动物健康和人类健康的潜在威胁。目前尚无针对GETV的商业化疫苗，因此，开发有效的疫苗候选株具有重要的现实意义。

本研究旨在系统比较一种高代次减毒GETV株（HuN1-P230）与其亲本毒株（HuN1）在表型和基因型上的差异，揭示减毒过程中与病毒致病性变化相关的分子机制。研究发现，HuN1-P230在细胞培养中表现出更快的复制动力学，更高的病毒滴度以及小斑块表型，这些特征均与减毒病毒的典型特征相吻合。更值得关注的是，在对怀孕小鼠的实验中，HuN1-P230感染并未导致胚胎吸收或死亡，所有新生仔鼠均存活，而亲本毒株HuN1则导致完全无活产，说明HuN1-P230具有显著的减毒特性。此外，通过挑战实验发现，HuN1-P230能够完全保护小鼠免受HuN1毒株的感染，这表明其具备良好的免疫保护能力。

为了进一步探讨HuN1-P230的减毒机制，研究者对其全基因组进行了分析，发现相较于HuN1，HuN1-P230在基因组中发生了26个核苷酸突变，其中包括11个沉默突变和15个氨基酸替换。这些突变主要分布在结构蛋白和非结构蛋白中，例如在E2糖蛋白中发生了7个氨基酸替换，其中5个突变集中在结构域B内。结构域B是GETV表面蛋白的重要区域，与受体识别密切相关，这些突变可能通过影响病毒与宿主细胞的相互作用，进而降低其致病性。此外，非结构蛋白nsP1、nsP3和nsP4也发生了多个氨基酸替换，其中nsP1的突变位点可能与病毒RNA帽化过程有关，nsP3的突变可能影响病毒复制复合体的形成，而nsP4的突变则可能影响病毒的RNA依赖性RNA聚合酶活性。这些分子变化可能共同作用，导致病毒在宿主体内表现出减毒特性。

为了验证这些突变是否影响病毒的抗原特性，研究团队进行了抗原性分析。通过使用小鼠免疫血清进行中和试验，发现HuN1-P230的中和抗体滴度显著高于其亲本毒株HuN1，这表明减毒过程可能增强了病毒的免疫原性。尽管HuN1和HuN1-P230的中和抗体滴度在某些情况下相似，但HuN1-P230诱导的免疫应答更偏向于同源抗原，这可能意味着减毒突变改变了病毒的抗原结构，使其在免疫系统中更易被识别。此外，结构分析显示，HuN1-P230的E2和E1糖蛋白在空间结构上发生了显著变化，这些变化可能影响病毒的受体结合能力或免疫逃逸机制，从而降低其致病性。

研究还发现，HuN1-P230的减毒过程可能涉及多个非结构蛋白的突变，而不仅仅是结构蛋白。例如，nsP2中的突变（V650A）可能影响其核定位能力，从而削弱病毒对宿主先天免疫系统的干扰。同样，nsP3中的两个突变（G344V和E446V）位于其高变异域（HVD），这一区域已被证实与病毒的致病性密切相关。此外，nsP4中的H175Y突变可能影响病毒的RNA复制能力，进一步降低其致病性。这些突变可能通过不同的机制协同作用，从而实现病毒的减毒效果。

此外，研究还探讨了HuN1-P230在不同宿主中的适应性。通过与全球其他GETV株的系统发育分析，研究者发现HuN1-P230与一些中国分离株具有较近的亲缘关系，这表明其在进化过程中可能经历了特定的适应性变化。这些变化可能帮助病毒在特定宿主中生存，同时保持较低的致病性。同时，研究团队还发现，HuN1-P230在结构域B和结构域III中的突变可能影响其在宿主细胞内的传播效率，从而降低其致病能力。

从免疫保护的角度来看，HuN1-P230不仅具有减毒特性，还表现出良好的免疫原性。在实验中，免疫HuN1-P230的小鼠在挑战实验中能够完全抵抗HuN1毒株的感染，这表明该株可能作为潜在的疫苗候选株。这一发现对于开发安全有效的GETV疫苗具有重要意义，尤其是在疫情高发地区，如中国。此外，研究团队还通过结构建模，揭示了HuN1-P230与HuN1在E2和E1糖蛋白上的差异，这些差异可能影响病毒的表面抗原性，从而增强免疫系统的识别能力。

研究结果表明，GETV的减毒过程是一个复杂的分子机制，涉及多个结构蛋白和非结构蛋白的突变。这些突变可能通过不同的方式影响病毒的复制、传播和致病性，进而降低其对宿主的威胁。同时，研究还发现，减毒株的免疫保护能力与其抗原性变化密切相关，这为未来的疫苗开发提供了重要的理论依据。通过进一步研究这些突变的具体作用机制，可以更全面地理解GETV的减毒过程，并为开发更有效的疫苗提供科学支持。

此外，研究团队还强调了病毒减毒过程中遗传稳定性的重要性。虽然HuN1-P230在减毒过程中表现出良好的安全性和免疫保护效果，但其在长期传代过程中是否保持稳定的减毒特性仍需进一步验证。因此，未来的研究应关注于评估HuN1-P230在不同条件下的遗传稳定性，以及其对异源GETV株的交叉保护能力。这些研究将进一步验证HuN1-P230作为疫苗候选株的可行性，并为其在动物和人类中的应用提供更坚实的科学基础。

综上所述，本研究揭示了GETV减毒过程中涉及的多种分子机制，为理解病毒致病性变化提供了新的视角。同时，HuN1-P230作为减毒株，不仅具有良好的安全性和免疫保护能力，还为未来GETV疫苗的开发提供了重要的候选材料。随着对病毒减毒机制的深入研究，可以期待更多基于GETV的疫苗产品在未来得以问世，从而有效控制其在动物和人类中的传播，减少其对公共卫生的影响。