WRKY27-RAP2.7调控模块通过调节肉桂醇脱氢酶7和谷胱甘肽S-转移酶F6来影响木质素生物合成及氧化还原平衡，从而增强植物的耐寒性

《Plant Biotechnology Journal》：WRKY27-RAP2.7 Regulatory Module Promotes Cold Tolerance via Modulation of Lignin Biosynthesis and Redox Homeostasis by Regulating Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase 7 and Glutathione S-Transferase F6

研究发现Ichang papeda中CiWRKY27通过直接激活CiCAD7（促进木质素合成）和CiGSTF6（清除活性氧）增强冷胁迫适应。CiWRKY27与CiRAP2.7形成转录调控复合体，协同激活CiCAD7。该模块通过提升细胞壁刚性和抗氧化能力，显著提高植物耐寒性，为柑橘抗寒育种提供新靶点。

　　冷胁迫对植物的生长发育具有显著的负面影响，尤其在柑橘类作物中，这种影响严重限制了果实的产量和品质。Ichang papeda（柑橘属植物）是一种耐寒性较强的柑橘种类，因此被视为研究植物冷适应机制的重要遗传资源。然而，尽管其耐寒特性受到广泛关注，但其背后的关键基因及其作用机制仍未被充分揭示。本研究通过一系列实验，发现CiWRKY27在Ichang papeda的耐寒性调控中发挥关键作用。CiWRKY27被鉴定为一种重要的正向调控因子，能够直接激活CiCAD7和CiGSTF6这两个基因，从而增强细胞壁的木质素合成和活性氧（ROS）的清除能力，提高植物的耐寒性。CiRAP2.7作为一种AP2/ERF家族的转录因子，能够与CiWRKY27形成物理互作，并协同放大CiCAD7的激活作用。此外，CiRAP2.7本身也被CiWRKY27调控，作为CiCAD7的转录激活因子，从而在耐寒过程中发挥重要作用。研究结果表明，CiWRKY27通过调控CiCAD7介导的木质素合成和CiGSTF6介导的ROS清除，共同促进植物的耐寒能力。这一发现不仅深化了我们对植物在冷胁迫下木质素合成和ROS稳态调控机制的理解，还为提升柑橘及其他作物的耐寒性提供了新的分子模块。

植物在冷胁迫下的反应涉及多个复杂的生理和分子过程。冷胁迫会引发细胞膜的流动性变化和膜蛋白构象的改变，进而影响细胞的整体功能。细胞壁作为植物细胞的外部屏障和机械支撑结构，不仅防止冰晶在细胞膜内形成，还在植物应对寒冷环境的过程中起到关键作用。木质素作为一种重要的细胞壁成分，通过其结构特性增强了细胞壁的稳定性，使其能够更好地适应低温环境。冷胁迫还会导致ROS的急剧积累，这被认为是植物应对寒冷胁迫的最早反应之一。因此，细胞壁的刚性以及红ox平衡的调控在植物耐寒性中具有重要意义。

研究中通过RNA-测序和DAP-seq（DNA affinity purification sequencing）分析，识别了CiWRKY27调控的717个潜在目标基因，其中许多与胁迫适应相关。CiWRKY27通过直接结合其目标基因的启动子区域中的W-box元件，激活CiCAD7和CiGSTF6的表达。CiCAD7编码的cinnamyl alcohol dehydrogenase（CAD）是木质素合成的关键酶，而CiGSTF6编码的glutathione S-transferase（GST）则参与ROS的清除过程。通过功能实验，验证了这两个基因在提高植物耐寒性中的正向作用。此外，CiRAP2.7作为AP2/ERF家族成员，能够与CiWRKY27形成复合体，协同调控CiCAD7的表达，从而增强木质素的合成。同时，CiRAP2.7本身也被CiWRKY27调控，进一步促进了其在冷胁迫下的表达。

研究还揭示了CiWRKY27在冷胁迫响应中的作用机制。CiWRKY27不仅能够单独调控其目标基因，还能与CiRAP2.7协同作用，形成一个复杂的调控网络。这一调控网络通过增强木质素的合成和ROS的清除能力，为植物提供了更强的抗寒保护。CiWRKY27的表达在冷胁迫条件下显著上升，并在植物不同组织中广泛表达，尤其是在果肉和茎中。其核定位特性表明，它可能在细胞核内直接调控目标基因的表达。通过一系列分子生物学实验，如酵母单杂交（Y1H）和双杂交（Y2H）实验，以及EMSA（电泳迁移率实验）和DLR（双荧光素酶报告基因）实验，研究者进一步验证了CiWRKY27与CiCAD7和CiGSTF6启动子的直接结合及其激活作用。这些实验结果表明，CiWRKY27不仅在启动子水平上调控这些基因的表达，还在转录激活效率上发挥了重要作用。

在植物耐寒性研究中，许多研究都关注了WRKY和AP2/ERF家族转录因子的作用。例如，WRKY46在梨中通过激活NAC187调控木质素合成，而RAP2.6在拟南芥中参与木质素的持续合成和伤口愈合过程。此外，MdERF61在苹果根部通过抑制mdm-miR397d的表达，增加MdLAC7b的转录，从而增强木质素沉积。然而，对于特定WRKY和ERF/AP2亚组的转录因子在木质素合成和冷胁迫响应中的具体作用，目前研究仍显不足。本研究首次揭示了CiWRKY27在冷胁迫下的关键作用，特别是在调控CiCAD7和CiGSTF6方面，为深入理解植物耐寒机制提供了新的视角。

CiRAP2.7的发现进一步拓展了我们对植物冷胁迫响应中转录因子调控网络的认识。CiRAP2.7不仅能够与CiWRKY27形成互作，还被CiWRKY27调控，表明两者之间存在复杂的调控关系。CiRAP2.7在冷胁迫下被显著诱导，其在植物细胞中的核定位表明其可能在细胞核内发挥调控作用。CiRAP2.7在冷胁迫下的表达增强，提示其可能通过调控下游基因的表达，参与植物的冷胁迫响应。实验表明，CiRAP2.7的沉默显著降低了Ichang papeda的耐寒能力，进一步验证了其在冷胁迫调控中的重要作用。

本研究不仅揭示了CiWRKY27和CiRAP2.7在植物耐寒性中的关键作用，还提供了具体的分子机制。CiWRKY27通过结合W-box元件直接激活CiCAD7和CiGSTF6的表达，从而增强木质素的合成和ROS的清除能力。CiRAP2.7则作为CiWRKY27的协同因子，通过与CiWRKY27形成复合体，增强其对CiCAD7的调控能力。这一调控网络不仅有助于理解植物在冷胁迫下的分子响应机制，还为未来植物抗寒育种提供了重要的基因资源和调控模块。

此外，研究还涉及了多个实验方法的综合应用，包括RT-qPCR、亚细胞定位分析、酵母杂交实验、EMSA、DLR实验等。这些方法的结合使得研究者能够系统地分析CiWRKY27的表达模式、调控网络以及其在植物耐寒性中的具体作用。例如，通过RT-qPCR分析，发现CiWRKY27在冷胁迫下表达显著上调，并且其在不同组织中的表达模式与耐寒性相关。通过酵母杂交实验，证实了CiWRKY27与CiRAP2.7之间的互作关系。EMSA实验进一步验证了CiWRKY27与W-box元件的直接结合，而DLR实验则显示了CiWRKY27对目标基因启动子的激活能力。

本研究的发现对于植物抗寒研究具有重要意义。首先，它揭示了CiWRKY27在冷胁迫响应中的关键作用，为理解植物耐寒性提供了新的分子视角。其次，它展示了CiWRKY27与CiRAP2.7之间的协同调控关系，进一步丰富了植物中转录因子相互作用的网络图谱。第三，它提供了具体的基因调控模块，即CiWRKY27通过调控CiCAD7和CiGSTF6，增强了植物的木质素合成和ROS清除能力，从而提高耐寒性。这一模块不仅适用于柑橘类植物，也可能适用于其他作物，为提升作物的抗寒能力提供了潜在的基因靶点和调控策略。

研究还发现，CiWRKY27的调控作用具有一定的组织特异性。在冷胁迫下，CiWRKY27的表达不仅在叶片中显著增强，还在茎和根中发挥重要作用。这一发现表明，CiWRKY27可能在不同组织中通过不同的机制参与耐寒性调控。此外，CiRAP2.7的表达模式也显示了其在植物不同部位的分布特征，如茎、叶和根，这提示其可能在多种组织中发挥功能，进一步丰富了其在冷胁迫响应中的角色。

综上所述，本研究通过系统分析CiWRKY27及其互作因子CiRAP2.7在冷胁迫下的作用机制，揭示了其在调控木质素合成和ROS清除中的关键角色。CiWRKY27通过直接结合目标基因的启动子区域，激活其表达，从而增强植物的耐寒能力。CiRAP2.7则作为协同因子，通过与CiWRKY27形成复合体，进一步放大其调控作用。这些发现不仅为理解植物耐寒性提供了新的分子基础，还为未来作物抗寒育种提供了重要的理论支持和实践指导。