C8orf33通过调控KAT8介导的H4K16乙酰化决定DNA双链断裂修复途径选择的新机制

《Cell Death & Disease》：C8orf33 dictates DNA double-strand break repair choice by modulating KAT8-mediated H4K16 acetylation

本研究揭示了C8orf33作为DNA双链断裂修复途径选择的关键调控因子。研究人员发现C8orf33通过拮抗KAT8乙酰转移酶的染色质结合，降低H4K16ac水平，从而促进53BP1招募、抑制DNA末端切除和HR因子招募，引导修复向NHEJ途径倾斜。该发现为理解基因组稳定性维持机制提供了新视角，对癌症治疗策略开发具有重要意义。

　　

在我们身体的每个细胞中，DNA每天都会遭受成千上万次的内源性和外源性损伤威胁，其中DNA双链断裂是最具毒性的DNA损伤形式之一。这些断裂如果得不到正确修复，将导致发育缺陷、免疫缺陷、早衰、神经退行性疾病和癌症等多种人类疾病。真核细胞进化出了复杂的DNA损伤应答网络，主要通过同源重组和非同源末端连接两种途径来修复DNA双链断裂。然而，细胞如何在这两种修复途径之间做出选择，一直是科学家们关注的焦点问题。

近期发表在《Cell Death and Disease》的一项研究为我们揭开了这一谜题的新篇章。以色列理工学院的研究团队发现了一个名为C8orf33的蛋白，它在决定DNA双链断裂修复途径选择中扮演着关键角色。这项研究不仅深化了我们对DNA损伤修复机制的理解，更为相关疾病的治疗提供了新的思路。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建C8orf33基因敲除细胞系；利用激光微辐照和AsiSI酶诱导系统在特定基因组位点产生DNA双链断裂；采用染色质免疫沉淀测序分析蛋白质与DNA的相互作用；通过流式细胞术评估同源重组和非同源末端连接修复效率；使用蛋白质组学技术分析组蛋白修饰变化；并利用免疫荧光显微镜观察DNA损伤位点修复蛋白的聚集情况。

C8orf33抑制同源重组并促进非同源末端连接修复DNA双链断裂

研究人员首先通过一系列实验证实，C8orf33的缺失会显著提高同源重组效率，同时降低非同源末端连接效率。利用Traffic Light Reporter系统同时检测两种修复途径的结果显示，C8orf33缺陷细胞中同源重组活性增加约50%，而非同源末端连接效率降低50-60%。这些发现表明C8orf33是DNA双链断裂修复途径选择的新型调控因子，倾向于促进非同源末端连接而抑制同源重组。

C8orf33被招募至DNA双链断裂位点

研究团队通过免疫荧光和激光微辐照实验发现，C8orf33主要定位于细胞核的核仁区域，并且能在DNA损伤后20秒内快速聚集到DNA损伤位点。染色质分级分析和染色质免疫沉淀实验结果进一步证实，内源性C8orf33在离子辐射和AsiSI诱导的DNA双链断裂后富集于染色质区域，表明C8orf33在DNA损伤应答中具有直接作用。

C8orf33促进53BP1向DNA双链断裂位点的招募

鉴于C8orf33缺失会导致非同源末端连接效率降低，研究人员推测其可能影响上游非同源末端连接因子53BP1的招募。染色质免疫沉淀和免疫荧光实验结果显示，C8orf33缺失显著降低了53BP1在DNA双链断裂位点的富集，而过表达C8orf33则增加53BP1的招募。值得注意的是，C8orf33缺失还导致DNA损伤后1小时γH2AX焦点的增加，表明C8orf33表达的精确调控对于正确的DNA双链断裂修复途径选择至关重要。

C8orf33抑制DNA末端切除和同源重组因子向DNA双链断裂位点的招募

为了阐明C8orf33抑制同源重组的分子机制，研究人员检测了C8orf33对DNA末端切除的影响。结果显示C8orf33缺失导致RPA2在AsiSI诱导的DNA双链断裂位点的富集显著增加。通过定量DNA末端切除实验进一步证实，C8orf33缺陷增加了AsiSI诱导的DNA双链断裂附近的单链DNA水平，同时伴随着BRCA1和RAD51招募的增加。这些结果支持C8orf33通过靶向53BP1向DNA双链断裂位点的招募来抑制DNA末端切除和同源重组因子招募的观点。

C8orf33调控KAT8介导的H4K16乙酰化

由于染色质环境在DNA双链断裂修复途径选择中起关键作用，研究人员分析了C8orf33缺失对组蛋白翻译后修饰的影响。蛋白质组学分析显示，C8orf33缺失导致含有H4K8ac、H4K12ac和H4K16ac的H4(5-18)肽段增加三倍。特别是H4K16ac水平的增加最为显著，而已知H4K16ac通过阻断53BP1同时促进BRCA1向DNA损伤位点的招募，从而有利于DNA双链断裂的同源重组修复。进一步实验表明，C8orf33对H4K16ac的调控主要通过影响KAT8而非TIP60乙酰转移酶实现。

C8orf33拮抗KAT8在DNA双链断裂位点的染色质结合

为了阐明C8orf33调控KAT8介导的H4K16ac水平的分子机制，研究人员发现C8orf33缺失并不影响KAT8的全局蛋白水平，但显著增加了染色质结合的KAT8水平。染色质免疫沉淀测序分析显示，C8orf33缺陷细胞在214个AsiSI诱导的DNA双链断裂位点表现出KAT8富集的显著增加，同时伴随H4K16ac水平的升高。这些数据提供了确凿证据表明C8orf33通过拮抗KAT8染色质结合来下调DNA损伤应答中的H4K16ac水平。

C8orf33通过调节H4K16ac水平调控DNA双链断裂修复途径选择

研究人员进一步探讨了C8orf33-KAT8轴在DNA双链断裂修复途径选择中的功能意义。结果显示，单独缺失C8orf33会增加H4K16ac水平，同时增加RAD51免疫荧光焦点形成并减少53BP1焦点形成，这与同源重组增强和非同源末端连接抑制相一致。然而，同时缺失C8orf33和KAT8可显著逆转这一表型，明显降低H4K16ac水平和RAD51焦点，同时增加53BP1焦点。修复效率检测实验进一步证实，C8orf33-KAT8共同缺失可恢复非同源末端连接效率，但以牺牲同源重组为代价。这些发现确立了C8orf33通过拮抗KAT8介导的H4K16ac沉积来指导DNA双链断裂修复途径选择的机制。

C8orf33缺陷导致基因组不稳定性

鉴于同源重组活性过高会导致核糖体DNA重复序列丢失和随后的细胞致死性，以及C8orf33主要定位于核仁，研究人员推测C8orf33缺失会损害核仁DNA双链断裂诱导后的rDNA重复序列稳定性。实验结果显示，在AsiSI和Cas9两种诱导系统下，C8orf33缺失均导致18S rDNA拷贝数的显著减少，同时伴随细胞存活率降低。值得注意的是，同时缺失C8orf33和KAT8可增加rDNA丰度并挽救细胞活力，表明C8orf33通过调节同源重组活性来保护rDNA稳定性。

这项研究建立了C8orf33与KAT8介导的H4K16乙酰化在调控DNA双链断裂修复途径选择中的新联系。研究结果表明，C8orf33被快速招募到DNA双链断裂位点，通过拮抗KAT8染色质结合来降低H4K16ac水平，从而促进53BP1招募并抑制DNA末端切除和同源重组因子招募，引导修复向非同源末端连接途径倾斜。这一发现完善了53BP1-BRCA1竞争决定DNA双链断裂修复途径选择的已有模型，并将C8orf33确立为该过程的关键上游调控因子。

值得注意的是，C8orf33不仅影响DNA双链断裂诱导后的H4K16ac水平，还在DNA双链断裂形成前调控H4K16ac水平，表明C8orf33通过监测H4K16ac水平在DNA双链断裂形成前就影响修复途径选择。此外，C8orf33缺陷导致的高同源重组活性引起rDNA重复序列丢失和细胞致死性增加，支持了C8orf33通过限制核仁区域过度的同源重组来保护rDNA重复序列基因组完整性的观点。

这项研究的发现具有重要的转化医学意义。鉴于C8orf33在多种癌症中过度表达，且其对同源重组的抑制作用可能使过表达C8orf33的肿瘤对PARP抑制剂敏感，C8orf33表达状态可能作为预测生物标志物指导治疗策略。同时，rDNA重复序列不稳定性在多种人类癌症中发现，C8orf33突变癌症可能对RNA聚合酶I抑制剂CX-5641敏感。未来的研究应探索C8orf33表达状态是否能作为预测生物标志物指导治疗策略，特别是在癌症精准医疗中的应用前景。