通过添加天然脂质脂多糖，细菌外膜转运蛋白FusA的结构得到了优化

《Journal of Structural Biology: X》：The structure of the bacterial outer membrane transporter FusA enabled by addition of the native lipid lipopolysaccharide

研究通过分子动力学模拟预测脂多糖（LPS）与外膜蛋白FusA的结合位点，发现LPS在β-seam区域及β11-13等位置与FusA形成强结合，并证实LPS的加入能显著稳定FusA结构，使冷冻电镜分辨率从13?提升至2.8?。该成果为解析其他小尺寸β- barrels外膜蛋白结构提供了新方法，并揭示了LPS通过静电和疏水相互作用调控蛋白构象的机制。

　　外膜蛋白（Outer Membrane Proteins, OMPs）是二层膜细菌（diderm bacteria）外膜中的一种重要蛋白，它们在细菌的生存、感染和抗生素抗性中扮演关键角色。OMP通常以β-桶结构（β-barrel）形式存在，这种结构由多个跨膜β折叠片（β-strands）组成，并通过短的细胞内回转（intracellular turns）和长的细胞外环（extracellular loops）连接。β-桶结构使得OMP在膜中具有独特的排列方式，也使其在结构生物学研究中成为挑战。在本研究中，科学家们探讨了脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）如何影响OMP的结构解析，特别是针对FusA蛋白，一种从植物病原菌*Pectobacterium atrosepticum*中提取的100 kDa的TonB依赖性外膜转运蛋白（TonB-dependent transporter）。

LPS是二层膜细菌外膜中特有的脂质成分，由4到7条酰基链和一个由糖链组成的外侧结构组成。LPS不仅在维持外膜结构完整性方面起重要作用，还可能影响OMP的构象变化，从而影响其功能。尽管已有部分研究揭示了LPS与某些OMP之间的相互作用，例如BtuB和FhuA，但LPS与OMP之间具体相互作用的机制、功能意义以及如何影响细菌的生理行为，仍存在许多未知。此外，LPS在抗生素抗性中的作用也引发了广泛关注，因为它可能通过改变外膜结构或影响蛋白质构象来阻止抗生素进入细菌内部。

在本研究中，科学家们发现，使用LPS辅助的冷冻电镜（cryoEM）技术能够成功解析FusA的高分辨率结构。尽管尝试使用多种优化方法对apo-FusA（未结合LPS的FusA）进行冷冻电镜结构解析，但结果并不理想，分辨率仅达到约13 ?。这表明FusA在没有LPS的情况下，可能由于结构的不稳定性或构象的多样性，难以被准确解析。然而，当FusA在去垢剂（如LDAO）中溶解后，加入LPS后，其结构解析变得可行，最终获得了2.8 ?的高分辨率结构。这一结果不仅展示了LPS在结构解析中的重要作用，还揭示了LPS与FusA之间可能存在的特定相互作用。

进一步的分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟显示，LPS在FusA表面具有多个结合位点，其中最显著的结合位点位于β-桶结构的β-seam区域附近。这一区域是FusA与LPS相互作用的关键部位，可能对维持其结构稳定性和功能调控具有重要意义。MD模拟还表明，Ra-LPS（一种不含O-抗原的LPS）比Re-LPS（不含糖链的LPS）更容易与FusA结合，并且能够形成更广泛的表面接触。这些结合位点包括β11-13、β14-16、β17-19和β21-β1等区域，显示出LPS与FusA之间的结构特异性。

冷冻电镜数据进一步验证了MD模拟的结果。通过分析FusA的非蛋白质密度（non-protein density），科学家们确认了LPS的结合位点，并观察到LPS在FusA的外侧区域更倾向于结合。这些结合位点不仅有助于维持FusA的结构稳定性，还可能影响其功能，例如通过稳定某些外膜区域的构象来促进特定物质的转运。此外，LPS的结合似乎也影响了FusA中某些结构域的位置，如插头域（plug domain）的排列。这表明，LPS可能在维持外膜蛋白的构象和功能方面起着关键作用。

研究还发现，LPS的结合不仅提高了FusA的结构解析能力，还可能影响其与其他蛋白质的相互作用。例如，FusA与TonB样蛋白FusB以及蛋白酶FusC协同作用，负责从植物中摄取并降解含铁的蛋白，从而释放铁元素供细菌利用。此外，某些抗菌肽（如pectocin M1和M2）能够利用FusA的结构，通过与之结合进入细菌的外膜，从而破坏其屏障功能。这些发现提示，LPS不仅是外膜结构的一部分，还可能在调节外膜蛋白功能和结构方面发挥重要作用。

本研究还强调了LPS在结构生物学中的潜在应用。由于许多OMP的结构解析受到其小尺寸和β-桶构象的挑战，添加LPS可能成为一种有效的辅助手段。LPS的结合不仅能够稳定OMP的构象，还可能通过提供额外的不对称信号，帮助克服冷冻电镜中的旋转平均（rotational averaging）问题。这一方法为其他类似结构的OMP研究提供了新的思路，并可能成为解决更多膜蛋白结构的通用策略。

在实验方法上，研究采用了多步骤的蛋白纯化和冷冻电镜数据采集与处理流程。FusA首先通过基因工程在*E. coli*中表达，并在去垢剂中溶解后进行冷冻电镜成像。为了提高图像质量，研究人员优化了网格制备和数据采集参数，包括使用不同的去垢剂、调整聚焦条件和使用先进的冷冻电镜检测器。此外，通过多次的二维分类（2D classification）和三维分类（3D classification），研究人员逐步筛选出高质量的粒子，并最终获得了高分辨率的结构模型。

在分子动力学模拟方面，研究使用了粗粒化（coarse-grained）模型，通过Martini力场（forcefield）对FusA与LPS的相互作用进行了建模。模拟结果显示，LPS在FusA的特定区域具有较高的结合倾向，尤其是β-seam区域和一些外膜表面区域。这些结合位点的分布与冷冻电镜观察到的LPS结合位置高度一致，进一步验证了模拟结果的可靠性。

研究还指出，LPS的结合可能对某些OMP的功能产生影响。例如，LPS可能通过稳定某些外膜区域的构象，帮助OMP在膜中保持特定的排列方式，从而影响其功能表现。此外，LPS与某些特定氨基酸（如精氨酸、赖氨酸和酪氨酸）的相互作用可能对OMP的构象变化和功能调控具有重要意义。这些发现不仅有助于理解LPS在细菌外膜中的作用，还可能为开发新的抗菌策略提供理论依据。

综上所述，本研究揭示了LPS在OMP结构解析和功能调控中的关键作用。通过冷冻电镜和分子动力学模拟的结合，研究人员不仅成功解析了FusA的高分辨率结构，还发现了LPS与FusA之间的特定结合位点和相互作用模式。这些发现为理解LPS在细菌外膜中的功能提供了新的视角，并可能为其他膜蛋白的结构研究提供借鉴。此外，研究还强调了LPS在维持外膜结构稳定性和调控蛋白质构象方面的潜在价值，这为未来研究细菌外膜蛋白的结构与功能关系提供了重要的参考。