综述：利用mRNA工程化骨组织：从分子设计与递送到临床应用

《Materials Today》：Engineering bone tissue with mRNA: from molecular design and delivery to clinical applications

骨再生中，非愈合骨折面临传统疗法如自体移植的局限性，化学修饰mRNA（cmRNA）通过提高稳定性、降低免疫反应和增强翻译效率成为新策略。cmRNA通过优化5'帽、poly(A)尾、UTR及核苷酸修饰（如假尿苷、5-甲基胞苷）克服裸mRNA的不稳定性及免疫原性。递送系统包括脂质纳米颗粒（LNPs）、聚合物（如PEI、壳聚糖）和杂交系统（如脂质-聚合物复合物），结合直接注射或体外转染细胞后移植实现高效递送。临床应用需解决剂量优化、长期安全性及规模化生产问题，但cmRNA的 transient表达和成本优势使其在骨修复中潜力显著。

　　骨组织具有在损伤后自我修复的内在能力，但这种能力在某些病理状态下会受到限制，如骨质疏松症、Paget病、成骨不全症或骨肿瘤等。对于这些难以愈合的骨折，目前主要依赖自体骨移植，但这种方法涉及额外的手术、患者不适和潜在并发症的风险。因此，科学家们正在寻找更安全、有效且经济的替代疗法，例如生长因子蛋白或质粒DNA的使用，但这些方法也存在成本高、免疫原性和安全性问题等限制。近年来，信使核糖核酸（mRNA）疗法因其在诱导骨再生方面的潜力而受到关注，成为一种有前途的替代方案。

mRNA疗法与DNA疗法相比，具有独特的优点。首先，mRNA在细胞质中起作用，无需进入细胞核，这消除了基因整合导致的插入突变风险。其次，mRNA的表达是瞬时的，并且可以完全降解，这使其具有良好的安全性。此外，通过化学修饰可以增强mRNA的稳定性、翻译效率，并减少先天免疫系统的激活，使其成为治疗应用中的多功能和高效工具。本文综述了用于提高mRNA性能的化学修饰类型、用于高效细胞摄取的递送策略（包括体内和体外途径），以及支持骨修复并实现空间和时间可控基因表达的生物材料支架设计。同时，还讨论了基于mRNA的治疗在临床转化中的潜力，包括安全性考虑、制造可扩展性和成本效益。

骨再生是一个复杂的生物学过程，涉及多种信号分子的协调作用。当前的临床策略在治疗非愈合或延迟愈合的骨折时存在局限性，如自体骨移植受限于供体部位的并发症、组织来源的限制以及患者不适。相比之下，mRNA疗法可以实现局部生产具有天然构象和翻译后修饰的成骨诱导因子，这在生物学和经济上都具有优势。此外，mRNA作为治疗剂，在安全性方面优于DNA，因为它不需要进入细胞核，也不会导致基因组整合。

然而，未经修饰的mRNA存在固有的不稳定性、免疫原性和低翻译效率等问题。为了解决这些局限性，化学修饰mRNA（cmRNA）已被开发出来。关键的修饰包括优化的5′帽结构（如反向帽类似物ARCA）、聚腺苷酸（poly(A)）尾、设计的5′和3′非翻译区（UTRs）以及部分或完全替代免疫原性核苷酸（如胞嘧啶和尿嘧啶）。这些修饰不仅提高了mRNA的稳定性，还减少了先天免疫激活，同时提升了翻译效率，使cmRNA成为骨折修复的有前途的治疗平台。

为了提高mRNA的治疗效果，科学家们还在探索新的mRNA格式，如自扩增mRNA（saRNA）和环形mRNA（circRNA）。saRNA包含病毒来源的复制机制，可以在细胞内实现mRNA的扩增，从而减少所需的输入材料并显著提高蛋白质产量。circRNA则采用共价闭合环结构，避免了5′或3′端的暴露，从而抵抗外切核酸酶的降解，支持持续的蛋白质翻译。这些新型mRNA格式为治疗应用提供了更长的表达时间和更高的效率。

在mRNA设计中，人工智能和机器学习的应用正在改变序列优化的策略。这些工具可以预测高效的UTR变体并生成针对特定治疗应用的合成序列。例如，通过训练大规模的UTR序列数据集，AI模型可以预测翻译效率并指导合成具有稳定性和高效性的UTR。这些方法在提高mRNA的翻译效率和减少免疫原性方面显示出巨大的潜力。

mRNA的递送是一个关键步骤，直接影响其在细胞内的功能。mRNA的分子量较大，且带有强烈的负电荷，这使得其难以自由穿过细胞膜。因此，需要设计有效的递送系统，以将mRNA带到目标细胞并确保其在细胞质中释放。目前，主要的递送策略包括物理方法、病毒载体和非病毒（化学）载体。其中，非病毒载体，特别是脂质纳米颗粒（LNPs），已被广泛应用于临床前和临床研究。LNPs由可离子化的脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇（PEG）脂质组成，这些成分协同作用，提高了mRNA的封装效率、稳定性和靶向性。

在体内和体外递送方面，科学家们采用了多种策略。例如，直接注射mRNA已被证明在动物模型中能够有效促进骨折愈合，但存在靶向性不足和局部免疫反应的风险。相比之下，体外递送方法涉及从体外提取细胞，进行基因修饰后再植入缺陷部位，这种方法可以提供更精确的控制，但也面临技术复杂性和成本高的问题。因此，结合支架的递送系统成为一种更受欢迎的策略，能够提高mRNA在目标部位的保留和持续释放，从而促进更有效的骨再生。

在支架设计方面，研究者们正在探索不同的材料和结构，以满足骨再生的需求。天然材料如胶原蛋白和纤维蛋白具有良好的生物相容性，但可能缺乏足够的机械强度。合成材料如聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和聚乙醇酸（PLA）提供了可调节的机械性能和大规模生产的优势，但其降解产物可能具有毒性。陶瓷材料如羟基磷灰石和β-磷酸三钙则因其良好的机械性能和生物相容性而受到关注，尽管它们可能在某些情况下过于脆弱。通过将这些材料结合，研究者们正在开发复合支架，以实现更全面的骨再生支持。

在临床应用方面，mRNA疗法在骨再生中的潜力得到了广泛认可。然而，要实现大规模临床转化，仍需克服多个挑战，包括确保mRNA的稳定性、降低免疫原性、提高翻译效率以及优化递送策略。此外，还需要进行详尽的药理学、毒理学和生物分布研究，并在大型动物模型中验证其有效性。尽管目前mRNA疗法在骨再生中的研究仍处于临床前阶段，但其在骨科领域的应用前景广阔，尤其是在处理复杂或延迟愈合的骨折时。

在经济性方面，mRNA疗法相比传统蛋白或DNA治疗具有显著优势。mRNA的生产过程避免了对动物来源材料的依赖，确保了批次间的稳定性，并且可以大规模生产。这使得mRNA疗法在成本效益方面更具吸引力，尤其是在治疗大量患者时。然而，要实现更广泛的应用，还需要进一步优化生产流程，以降低成本并提高可扩展性。

尽管mRNA疗法在安全性方面具有优势，但仍然存在潜在的风险。例如，高剂量的mRNA可能激活先天免疫系统，导致炎症反应或细胞毒性。此外，某些递送载体可能引起细胞膜的破坏，导致氧化应激或线粒体功能障碍。因此，需要在mRNA的化学修饰和载体设计方面进行理性优化，以减少这些风险。

综上所述，化学修饰mRNA作为骨再生的下一代治疗手段，具有克服现有治疗局限性的潜力。通过不断优化mRNA的设计、递送策略和支架材料，可以提高其在骨修复中的应用效果。同时，人工智能和机器学习的引入为mRNA疗法的个性化和精准治疗提供了新的可能性。随着这些技术的不断发展和成熟，mRNA疗法有望成为一种安全、高效且经济的骨再生治疗方案。