用于检测金黄色葡萄球菌的双模态比色和电化学发光生物传感器集成便携式设备

《Microchemical Journal》：Dual-modality colorimetric and electrochemiluminescence biosensor integrated portable devices for Staphylococcus aureus detection

本研究开发了一种集成电化学发光（ECL）和比色法的双模式生物传感器，用于快速检测海鲜中的金黄色葡萄球菌（S. aureus）。该传感器利用自增强的DPEA-AuNCs纳米复合材料，通过磁性Fe3O4纳米颗粒实现固液分离，S. aureus结合aptamer后使DPEA-AuNCs脱离，分别产生ECL信号衰减和比色法（TMB显色）的阳性响应。结合智能手机RGB图像分析小程序，实现检测限1.78-2.35 CFU/mL的高灵敏度定量分析，显著简化操作流程并提升检测效率。

　　

颜璐婷|张宇豪|王超|田雷|任泽坤|孙霞|郭亚敏|李发兰|杨晴晴|张燕燕

山东工业大学农业工程与食品科学学院，中国淄博新村镇西路266号，255049

摘要

本研究开发了一种双模式生物传感器，结合了电化学发光（ECL）和比色法来检测海产品中的金黄色葡萄球菌（S. aureus）。该生物传感器使用自增强金纳米簇（DPEA-AuNCs）作为发光材料，在无需共反应物的情况下即可产生正电位峰，有效减少了不稳定性的问题。此外，DPEA-AuNCs具有类似酶的活性，在H₂O₂存在下催化底物3′ 3′ 5′ 5′-四甲基联苯胺（TMB）生成蓝色反应产物，便于视觉检测。通过适配体将DPEA-AuNCs固定在磁性四氧化三铁（Fe₃O₄）纳米颗粒上，实现磁场驱动的固液分离：沉淀物用于ECL检测，上清液用于吸光度测量。当S. aureus与适配体结合时，DPEA-AuNCs从Fe₃O₄上脱离，导致ECL信号强度减弱；而上清液中的DPEA-AuNCs会催化TMB底物，使其颜色变为蓝色。我们开发了一个Microsoft迷你程序来分析RGB值与S. aureus浓度之间的相关性，以实现快速检测。该生物传感器的检测限分别为1.78 CFU/mL（ECL模式）和2.35 CFU/mL（比色模式）。这种方法在简化操作的同时，展现了较高的检测灵敏度和准确性，为食品安全检测提供了一种直观高效的方法。

引言

金黄色葡萄球菌（S. aureus）是一种存在于海产品中的食源性病原体，可引发多种感染，包括腹泻和肺炎[1,2]。目前已开发出多种分析技术来检测S. aureus，如表面增强拉曼光谱（SERS）[3]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[4]和聚合酶链反应（PCR）[5]。尽管这些传统微生物检测方法相对准确，但通常需要复杂的操作流程、昂贵的设备和较长的检测周期。例如，PCR检测可能需要数小时，而ELISA检测则需要12至24小时，这限制了它们在水产品检测中的应用[6,7]。相比之下，电化学发光（ECL）是一种相对简单快捷的方法，不仅有效避免了传统方法的缺点，还具有高灵敏度和快速响应时间[8]。然而，传统的电化学发光方法需要大型设备，并且涉及容易引入背景干扰的共反应物。金纳米簇（AuNCs）是一种新兴的ECL材料，在细胞标记、生物成像和生物传感方面具有潜在应用[9]，但其电子耦合传输效率较低，限制了其更广泛的应用[10]。自增强ECL方法通过将共反应物和发光体共价连接在一个分子内，有效提高了ECL效率[11, [12], [13]]。受此启发，我们使用共反应促进剂N,N-二异丙基乙二胺（DPEA）制备了自增强AuNCs（DPEA-AuNCs）。与普通AuNCs相比，DPEA-AuNCs通过缩短电子传输距离、消除过量共反应物和减少能量损失，显著增强了ECL信号[14]。

AuNCs具有类似过氧化氢酶的活性，在H₂O₂存在下催化3′ 3′ 5′ 5′-四甲基联苯胺（TMB）氧化为蓝色产物[15]。AuNCs的ECL能力和催化活性为S. aureus的检测提供了新的思路。同时，纳米四氧化三铁（Fe₃O₄）具有磁性、良好的生物相容性和可吸附性，并且在外加磁场下可聚集，为构建双模式生物传感器提供了基础[16]。双模式生物传感器结合多种检测技术，提高了检测灵敏度和特异性，同时减少了误差[17]。比色法是一种通过测量颜色强度来分析溶液组成的生化方法[18]。ECL与比色法的结合结合了比色法的直观性和ECL的高灵敏度[19]。当比色法显示信号变化时，ECL可以提供额外的定量数据，确保检测准确性[20]。利用智能手机可以方便地进行比色分析，智能手机因其易用性和日益强大的处理能力而成为流行的检测工具[21]。通过开发一个微信小程序，用户可以利用智能手机的摄像头快速拍摄样品的颜色图像，并通过内置的颜色分析算法进行分析，从而快速确定目标浓度[22]。这种方法不仅减少了传统设备的需求，还加快了检测过程并简化了操作流程。

本文开发了一种用于检测S. aureus的比色和ECL双模式生物传感器。该传感器使用了同时具有ECL活性和H₂O₂催化活性的DPEA-AuNCs纳米复合材料，并结合了智能手机识别功能。合成的发光材料DPEA-AuNCs表现出优异的ECL信号和颜色，为我们的双模式检测系统奠定了基础。磁性Fe₃O₄纳米颗粒用于固定DPEA-AuNCs，实现固液分离，并在特定S. aureus浓度下释放DPEA-AuNCs。磁性分离能够有效区分沉淀物和上清液中的DPEA-AuNCs，产生不同强度的ECL和比色信号。通过智能手机和自定义的微信小程序进行RGB分析，可以量化颜色变化。这种方法提高了检测灵敏度、准确性和效率，为食品安全检测提供了一种直观的可视化方法。

材料与试剂

所用试剂如下：过氧化氢（H₂O₂购自Sinopharm Holding Co., Ltd.；6-巯基-1-己醇（MCH）和HAuCl₄·3H₂O购自Sigma-Aldrich（上海）；硫酸、纳米氧化铈（CeO₂）、纳米氧化铁（Fe₃O₄）、氢氧化钠（NaOH）和氨购自Aladdin Reagent（上海）；三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）购自北京Suomobao Technology Co., Ltd.；甲硫氨酸（Met）和N,N-二异丙基乙二胺（DPEA）。

双模式生物传感器的构建过程

首先，在图1A中展示了CeO₂-Au的合成过程。CeO₂用3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）进行氨基修饰，然后在其表面静电吸附AuNPs，以提高其电导率、生物相容性和催化性能。图1B展示了磁性Fe₃O₄-DNA1的制备过程，其中DNA1被固定在Fe₃O₄上，以识别S. aureus。图1C展示了DPEA-AuNCs-DNA2的制备过程。

结论

本研究构建了一种结合ECL和比色技术的双模式生物传感器。通过比色变化和ECL信号变化实现了S. aureus的双模式检测。自增强发光材料DPEA-AuNCs因其能够产生正电位依赖的ECL信号并催化显色底物的反应而被选用，为双模式检测平台的构建奠定了稳定基础。

CRediT作者贡献声明

颜璐婷：撰写——原始稿件、方法学设计、概念构思。张宇豪：撰写——审阅与编辑、数据管理。王超：撰写——审阅与编辑、实验研究。田雷：验证工作。任泽坤：撰写——审阅与编辑、实验研究。孙霞：数据分析。郭亚敏：数据分析。李发兰：资源协调。杨晴晴：资源准备。张燕燕：撰写——审阅与编辑、监督、资源协调、概念构思。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32402232）和山东省农业优良种子项目（项目编号：2023LZGCQY004）的支持。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

作者衷心感谢所有提供的资金支持。