《Pathology - Research and Practice》：ATF4 Transcriptional Regulation of OMD and STC2 Drives Vascular Calcification Progression via the PI3K/AKT Pathway
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血管钙化（VC）的分子机制涉及ATF4调控骨形态发生蛋白2（BMP2）及STC2等基因，激活PI3K/AKT通路促进平滑肌细胞骨分化。本研究整合转录组数据与体外/体内实验，发现ATF4通过调控OMD和STC2表达促进VC，并验证其与临床钙化标志物的相关性。
Zhang Yue | Ming-Yan Wang | Chun-Ze Yuan | Jin-Wen Xu | Ke-Ke Shao
江苏省人民医院盐城临床医学院实验室医学系，中国江苏省盐城市224001
摘要
血管钙化（VC）是一种以血管内磷酸钙晶体沉积为特征的病理过程。尽管其具有临床意义，但其背后的分子机制仍不甚明了。本研究整合了公共数据集中的转录组数据和实验模型，以识别VC的关键调控因子。使用成骨培养基（OM）诱导人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）发生钙化，随后进行转录组测序。通过差异基因表达、功能富集和基于机器学习的枢纽基因识别方法进行分析。并通过体外和体内模型进行了实验验证。转录组分析发现了278个差异表达基因（DEGs），其中45个与代谢相关。生物信息学和机器学习方法表明Osteomodulin（OMD）和Stanniocalcin 2（STC2）是VC的关键调控因子。iRegulon工具预测OMD和STC2共享一个共同的转录因子——激活转录因子4（ATF4）。在钙化的人血管组织中，ATF4、OMD和STC2的表达水平显著升高，这与RUNX2、ALP和OCN等钙化标志物的增加相关。功能研究表明，ATF4通过结合其启动子区域转录上调OMD和STC2的表达，进而激活PI3K/AKT信号通路，促进HASMCs的成骨分化。使用AAV-SM22α-shATF4的体内实验证实，靶向ATF4可以通过抑制OMD和STC2的表达及减少钙沉积来缓解VC。总之，我们的研究揭示了ATF4通过转录上调OMD和STC2来促进血管钙化，进而激活PI3K/AKT信号通路。这些发现为VC信号网络中信号节点之间的直接调控关系提供了新的证据。
引言
血管钙化（VC）是指血管内磷酸钙晶体的沉积，是多种代谢性疾病（包括动脉粥样硬化、糖尿病、高血压和慢性肾病（CKD）的标志[1] [2]。它是全球发病率和死亡率的主要决定因素[3] [4]。与被动退行性过程不同，VC是一种主动且高度调控的生物现象，涉及炎症、氧化应激、细胞外基质重塑、钙磷代谢紊乱以及异位矿化[5] [6]。驱动VC的关键机制是人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）的成骨分化，这些细胞从收缩型转变为类似成骨细胞的表型，并分泌作为磷酸钙沉积核化点的基质囊泡[7]。这种表型转变会导致血管硬化、斑块形成以及心血管不良事件（如破裂和夹层）的风险增加[8]。在成骨分化过程中，HASMCs表现出成骨标志物（如碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白、骨钙素、骨形态发生蛋白2（BMP-2）和osterix）的表达增加，这些因子对钙沉积和基质重塑至关重要[9] [10]。尽管取得了这些进展，但调控这些过程的分子驱动因素，特别是连接代谢途径和成骨途径的转录调控因子，仍不完全清楚。值得注意的是，激活转录因子4（ATF4）是一种关键的应激反应调节因子，参与内质网（ER）应激和骨代谢，已被认为是心血管组织中病理钙化的潜在介质[11] [12]。然而，其在驱动血管平滑肌细胞成骨转分化中的具体作用仍不清楚。
近年来，基于高通量测序的转录组分析已成为识别潜在治疗靶点的有用工具[13]。然而，样本可用性和实验条件的限制，特别是在临床环境中，使得大规模数据收集变得具有挑战性。为了解决这些问题，整合多个数据库的全面分析至关重要。
在本研究中，我们利用了Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中的转录组数据和我们中心的样本，以识别与HASMCs成骨分化和代谢密切相关的基因。首先，从在钙化诱导培养基中培养的HASMCs中鉴定出差异表达基因（DEGs），并选取了一部分与代谢相关的基因进行进一步分析。使用两个独立的GEO数据库进行了验证，随后选择并评估了与钙化标志基因共表达的DEGs的相关性。随后，我们在小鼠和人血管组织中确认了关键枢纽基因的表达。此外，我们还探讨了这些基因在HASMCs钙化模型中的上游和下游调控机制，为血管钙化的分子网络提供了宝贵的见解。通过体外和体内模型进行了实验验证。这些发现补充了目前对VC调控途径的理解，并为识别潜在治疗靶点提供了新的视角。
章节片段
人钙化血管组织
人钙化血管组织来自接受血管手术的患者。部分血管组织用于原代细胞分离，另一部分用于组织学分析，其余部分用于RNA和蛋白质提取。所有患者在纳入研究前均签署了知情同意书，本研究遵循赫尔辛基宣言，并得到了南京医科大学第一附属医院伦理委员会的批准
差异表达基因的鉴定
HASMCs的成骨分化是血管钙化的一个关键病理过程，尽管其背后的机制仍不甚明了，但全面了解VC的发病机制对于开发有效的治疗策略至关重要。为了研究VC的分子基础，我们使用成骨培养基诱导HASMCs发生钙化，并进行了转录组测序。该分析发现了278个与VC相关的差异表达基因（DEGs）
讨论
心血管钙化（VC）是一个日益严重的全球健康和经济挑战，尤其是在高磷血症和慢性肾病（CKD）患者中，动脉钙化显著增加了心血管疾病的发病率和死亡率[27]。尽管其具有临床重要性，但其背后的分子机制仍不够清楚，有效的治疗策略也尚未问世。高通量测序技术的出现以及相关数据的可用性为研究提供了支持
结论
总之，本研究揭示了ATF4通过转录调控OMD和STC2来促进血管钙化的新机制，从而激活PI3K/AKT信号通路。这些发现加深了我们对VC病理生理学的理解，强调了ATF4作为一个有前景的治疗靶点，并为VC信号网络中信号节点之间的直接调控关系提供了新的证据。
伦理批准和参与同意
所有涉及人类的研究均遵循赫尔辛基宣言，并得到了南京医科大学第一附属医院伦理委员会的批准（IRB编号：2019-SR-067）
资助
本研究得到了2023年盐城市重点研发计划（项目编号：YCBE202345）的支持。
CRediT作者贡献声明
Zhang Yue：写作——审稿与编辑、软件处理、数据管理。Ming-Yan Wang：写作——初稿撰写、正式分析。Chun-Ze Yuan：写作——初稿撰写、正式分析。Jin-Wen Xu：资金筹集。Ke-Ke Shao：写作——审稿与编辑、资金筹集。
致谢
我们感谢Shanghai NewCore Biotechnology Co., Ltd.的Mingjie Chen在数据分析和可视化方面提供的支持。
