现代化抗体纯化平台流程，以提高杂质清除效率

《Separation and Purification Technology》：Modernizing the platform process of antibody purification for enhanced impurity clearance

单克隆抗体（mAb）纯化平台通过结合新型多模态树脂（LigaGuard和SEMM）与Protein A亲和层析，显著提升杂质清除率（HCPs<60 ppm，hcDNA<10 ppb）和生产效率（最高全球产量86%），同时延长Protein A树脂寿命。工艺C通过前置LigaGuard去除高风险HCPs和hcDNA，再经Protein A捕获和SEMM纯化，实现最优平衡。

　　在生物制药领域，单克隆抗体（mAb）的纯化是一个至关重要的环节，它直接关系到最终产品的安全性和有效性。传统的mAb纯化平台主要依赖于Protein A亲和捕获，随后通过一系列精制步骤去除杂质。尽管这一方法已经成功地实现了大规模的mAb生产，但在面对新型mAb格式和上游工艺的强化时，仍存在一些挑战，如难以清除的宿主细胞蛋白（HCPs）、抗体聚集物以及产品相关的小分子和大分子杂质。为了应对这些挑战，本研究提出了一种创新的mAb纯化平台，结合了新型多模式树脂和传统Protein A层析技术，以提高纯化效率和过程鲁棒性。

Protein A亲和层析因其高选择性和对澄清后的细胞培养清液（CCCF）中mAb的高效富集而成为行业标准。然而，Protein A在去除某些高风险HCPs和防止产品聚集方面存在局限性。为了解决这些问题，研究团队开发了两种新的树脂：一种是LigaGuard，专门用于通过流穿模式选择性地去除高风险和持久性的HCPs、染色质和聚集物；另一种是尺寸排除-混合模式（SEMM）树脂，用于高效去除产品相关的小分子和大分子杂质及残留的工艺相关杂质。这两种树脂的引入，使得在Protein A捕获后能够进行更有效的精制。

研究团队系统地评估了多种替代工艺配置，以最大化纯化性能和过程的稳定性。其中，Process A、Process B和Process C分别代表了不同的工艺设计。Process A以Protein A作为主要捕获步骤，随后通过LigaGuard和SEMM树脂进行两步精制，最终实现了高达86%的全球收率，残留产品相关杂质低于1%，HCPs低于60 ppm，hcDNA低于10 ppb。Process B则将LigaGuard替换为商业化的Eshmuno CP-FT树脂，尽管其在去除聚集物方面表现出色，但在清除工艺相关杂质方面略逊于Process A。Process C则采用了不同的顺序，首先使用LigaGuard去除大部分工艺相关杂质，再通过Protein A进行产品浓缩和纯化，最后使用SEMM树脂进行精制，从而显著提高了整体收率和产品纯度。

在实验设计中，研究团队使用了三种不同的CCCF，分别包含mAb1、mAb2和mAb3。这些mAb均属于IgG1分子，具有相似的分子量（约150 kDa）。每个CCCF的纯度和杂质水平各不相同，其中mAb1含有较高水平的低分子量（LMW）和高分子量（HMW）物种，以及HCPs和hcDNA。mAb2则以高分子量物种为主，而mAb3的titer较高，但其HMW物种的含量相对较低。通过不同的工艺配置，研究团队成功地调整了纯化步骤的顺序和条件，以适应不同mAb的特性。

在纯化过程中，LigaGuard树脂在流穿模式下能够有效去除HCPs和hcDNA，同时还能捕获与HCPs结合的HMW杂质。这一特性使得LigaGuard在处理含有高HCPs和hcDNA的CCCF时，能够显著提高后续步骤的效率。SEMM树脂则通过尺寸排除和混合模式相互作用，进一步去除残留的杂质，特别是小分子和大分子杂质。实验结果显示，SEMM树脂能够将残留的HCPs和hcDNA水平降至极低的范围，从而确保最终产品的高纯度。

此外，研究团队还对各个工艺步骤的生产力进行了评估。通过计算每个步骤的单位时间产量和总体工艺时间，他们发现使用流穿模式的精制步骤（如LigaGuard和SEMM树脂）能够显著提高整体工艺的效率。特别是在处理高titer的CCCF时，这种工艺配置的优势更加明显。例如，mAb3的高titer使得Process A和Process C在纯化效率和生产力方面表现尤为突出。

在蛋白质组学分析方面，研究团队利用先进的分析技术，如质谱分析，对不同工艺步骤的中间产物和最终产物进行了详细评估。结果显示，LigaGuard和SEMM树脂能够有效去除多种高风险HCPs，包括与mAb相互作用的蛋白酶、热休克蛋白和染色质等。这些结果不仅验证了新工艺的高效性，还揭示了不同工艺配置在去除特定杂质方面的差异。

然而，值得注意的是，流穿模式在分离mAb的电荷变体方面存在一定的局限性。电荷异质性通常由脱酰胺化、氧化、糖化或C端赖氨酸变异引起，这些变异可能影响最终产品的质量和安全性。因此，对于需要严格控制电荷变体的产品，可能需要结合使用电荷交换（CEX）步骤和流穿模式的精制步骤。此外，研究团队还讨论了单用SEMM树脂可能带来的废物处理问题，因为其会捕获HCPs、hcDNA以及小分子和大分子杂质，从而产生污染的固体废物。然而，由于SEMM树脂的体积相对较小，且可以焚烧回收能量，这种废物问题在大规模生产中可以得到有效管理。

总体而言，这项研究为mAb的纯化提供了一种新的平台，通过整合先进的流穿模式多模式层析技术和传统的Protein A亲和层析，不仅提高了纯化效率，还增强了对工艺和产品相关杂质的清除能力。该平台特别适用于高titer的CCCF，以及需要最大化收率和纯度的长期生产项目。未来的工作将包括对这些新工艺的全生命周期评估，以比较其与传统工艺在环境影响、能耗、水耗和废物产生等方面的差异，从而进一步推动mAb制造的现代化。