高催化活性的Zn?V?O?/g-C?N?异质结纳米片，用于基于适配体的无标记超灵敏电化学检测神经元特异性烯醇酶：通过原位形成血红素/G-四链纳米线实现该目标

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Highly catalytic Zn 3V 3O 8/g-C 3N 4 heterojunction nanosheets for aptamer-based and label-free ultrasensitive electrochemical sensing of neuron-specific enolase via in situ formation of hemin/G-quadruplex nanowires

神经特异性烯醇化酶（NSE）的高灵敏电化学检测方法，基于Zn?V?O?/g-C?N?异质结纳米片与DNAzyme驱动的3D步行系统及血红素/G四联体纳米线信号放大策略，实现检测下限36.4 fg mL?1，适用于复杂生物样本检测，为SCLC早期诊断提供新工具。

　　在医学领域，早期诊断对于提高疾病治疗的成功率具有至关重要的意义。小细胞肺癌（SCLC）作为一种高度恶性的肿瘤，其特点是快速增殖、早期转移和较差的预后，因此，能够实现对SCLC相关生物标志物的高灵敏度检测技术显得尤为重要。神经特异性烯醇化酶（NSE）作为一种在神经元和神经内分泌细胞中高度表达的酶，已被广泛认可为SCLC的可靠、精准和灵敏的血清标志物。NSE在SCLC患者血清中的浓度显著升高，且其水平的上升通常在疾病复发前1-3个月就能提供临床或影像学上的证据。这使得NSE成为监测SCLC患者治疗后病情进展的重要指标。

然而，目前NSE的检测方法仍存在一定的局限性。传统的检测手段，如化学发光免疫分析（CLIA）和电化学发光分析（ECL）虽然在临床中被广泛应用，但它们通常需要昂贵的仪器设备和严格的样本质量要求，这在实际应用中带来了诸多不便。此外，酶联免疫吸附测定（ELISA）和侧向流动免疫测定（LFIA）虽然操作简便，但它们在检测低浓度NSE时表现出的分析灵敏度不足，难以满足对微量NSE的精确检测需求。因此，开发一种简便、高灵敏度的NSE检测平台，成为临床诊断领域亟需解决的问题。

在这一背景下，电化学生物传感技术因其独特的性能优势，包括极高的灵敏度、出色的分子特异性、快速的响应能力和良好的微型化潜力，逐渐成为检测多种生物标志物的重要工具。为了进一步提高电化学检测的灵敏度，研究者们开发了多种信号放大策略，例如聚合酶链式反应（PCR）、引物交换反应（PER）和杂交链式反应（HCR）。与此同时，DNA纳米技术的进步也为生物传感领域带来了新的机遇，例如DNA马达和DNA步行者等功能性纳米机器的应用，使得信号放大更加高效。特别是三维DNA步行者，因其操作效率高、负载能力强，被认为是提升生物传感性能的重要手段。

DNA步行者是一种基于DNA分子的纳米级运动装置，其运行依赖于特定的驱动力。其中，DNA酶（DNAzyme）因其高度的催化效率和热稳定性，被认为是驱动DNA步行者最有效的选择。DNA酶是一类能够催化核酸底物水解的特殊DNA分子，其催化活性在特定金属离子（如Mg2?和Zn2?）的存在下被显著增强。相比传统的蛋白质酶，DNA酶具有更强的稳定性，并且可以实现多次循环的催化反应，这表明由DNA酶驱动的自供电三维DNA步行者系统在下一代生物传感平台中具有广阔的应用前景。

在这一研究中，科学家们设计了一种基于三维DNA步行者和hemin/G-四链体（GS）纳米线的信号放大策略，结合Zn?V?O?/g-C?N?异质结纳米片作为高效的催化材料，成功构建了一种高灵敏度、无需标记的电化学NSE适配体传感器。这种传感器不仅能够实现对NSE的超灵敏检测，还具备良好的选择性和稳定性，适用于复杂生物样本中的NSE检测。Zn?V?O?/g-C?N?异质结纳米片的合成过程采用了一种简便的水热法，通过精确控制反应条件，获得了具有高催化活性的纳米结构。

g-C?N?作为一种新型的二维非金属有机半导体材料，其结构类似于石墨的层状结构，具有良好的化学稳定性、独特的电子结构和优异的热稳定性。在电化学检测应用中，g-C?N?因其独特的多孔结构和高表面积活性位点密度，表现出良好的潜力。通过构建异质结构，g-C?N?与其他半导体之间的界面可以被优化，从而调整电子带分布，显著提高材料的导电性。例如，Z-方案异质结结构能够有效增强光生载流子的分离性能，并促进光生电子-空穴对的分离过程，使得电子在导带的高能级积累，而空穴则在价带的低能级积累。这种能量分布使得复合催化剂能够维持较高的氧化还原能力，从而提高催化效率。

此外，V氧化物半导体与g-C?N?的能带结构具有良好的匹配性，进一步增强了催化性能。Zn?V?O?不仅表现出优异的热稳定性，还具有较高的电导率，能够形成更有效的电子传输通道，降低电荷转移阻抗，从而显著提升其催化活性。在实际应用中，这种异质结纳米片被用作催化底物，并结合DNA酶驱动的三维DNA步行者系统，实现了对hemin/GS纳米线的在位组装。通过这一系列信号放大策略，NSE的检测灵敏度得到了显著提升，检测限低至36.4 fg/mL，在0.1至1000 pg/mL的动态范围内均能实现高精度检测。

该方法的检测原理基于适配体与NSE分子的特异性结合。当NSE分子与含有GS结构和rA位点的DNA双链探针结合时，会触发DNA酶驱动的三维DNA步行者系统的自动运行，从而实现对多个hemin/GS纳米线的在位生成。这一过程通过hemin的电还原反应产生显著的电流响应，进而实现对NSE的高灵敏度检测。这种结合了多种信号放大策略的检测方法，不仅提高了检测的灵敏度，还增强了检测的特异性，使得该传感器能够有效区分其他非目标分子的干扰，提高检测的准确性。

在实际应用中，该传感器能够用于检测稀释后的复杂生物样本中的NSE分子，这对于SCLC的早期诊断具有重要意义。由于NSE在SCLC患者血清中的浓度升高与疾病复发密切相关，因此，能够实现对NSE的高灵敏度检测，有助于医生更早发现疾病的复发迹象，从而采取及时的干预措施。此外，该检测平台还具备良好的可重复性和稳定性，使得其在临床应用中具有广泛的应用前景。

为了实现这一检测目标，研究团队设计了一种基于适配体、三维DNA步行者和hemin/GS纳米线的信号放大体系。其中，适配体作为检测的特异性识别元件，能够与NSE分子特异性结合。这种结合不仅触发了DNA酶驱动的三维DNA步行者系统的运行，还导致了对多个hemin/GS纳米线的在位生成。通过hemin的电还原反应，这些纳米线能够产生显著的电流响应，从而实现对NSE的高灵敏度检测。该方法的关键在于如何有效地整合多种信号放大策略，使得整个检测过程能够达到更高的灵敏度和选择性。

在实验设计中，研究人员首先合成了Zn?V?O?/g-C?N?异质结纳米片，并将其修饰在玻璃碳电极（GCE）表面，作为催化反应的平台。随后，通过在1% HAuCl?溶液中进行电沉积，固定了金纳米颗粒（AuNPs），进一步增强了电极的催化性能。为了实现信号放大，研究人员还设计了含有GS结构和rA位点的DNA探针，并通过磁珠（MNBs）固定了这些探针。当NSE分子与适配体结合时，会触发DNA酶驱动的三维DNA步行者系统的运行，从而实现对多个hemin/GS纳米线的在位生成。

这一系列反应不仅提高了检测的灵敏度，还增强了检测的特异性。通过hemin的电还原反应，研究人员能够观察到显著的电流响应，这表明NSE的存在能够被有效检测。此外，hemin/GS纳米线的形成过程能够提供更多的活性位点，使得hemin的催化反应更加高效。这种信号放大策略的引入，使得整个检测系统能够在不依赖标记的情况下实现对NSE的高灵敏度检测，这在实际应用中具有重要意义。

综上所述，这项研究成功构建了一种基于Zn?V?O?/g-C?N?异质结纳米片、三维DNA步行者和hemin/GS纳米线的信号放大策略的高灵敏度、无标记的电化学NSE适配体传感器。该传感器不仅能够实现对NSE的超灵敏检测，还具备良好的选择性和稳定性，适用于复杂生物样本中的NSE检测。这一成果为SCLC的早期诊断提供了新的技术手段，具有重要的临床应用价值。同时，该研究也为其他生物标志物的检测提供了新的思路，推动了电化学生物传感技术的发展。