抑制铁死亡可增强人造血干细胞体外扩增——为移植和基因治疗开辟新途径

《Nature Cell Biology》：Inhibiting ferroptosis enhances ex vivo expansion of human haematopoietic stem cells

本研究针对人类造血干细胞（HSC）体外扩增过程中大量丢失的难题，发现铁死亡（ferroptosis）是导致HSC损耗的关键机制。通过使用liproxstatin-1（Lip-1）和ferrostatin-1（Fer-1）等铁死亡抑制剂，研究人员在无血清培养和化学限定条件下显著提高了脐带血和成人来源HSC的扩增效率。扩增后的细胞保持干细胞表型和分子特征，在小鼠异种移植模型中实现持久多系重建，且无基因毒性或造血异常。该研究不仅揭示了铁死亡调控HSC稳态的新机制，还为临床造血干细胞治疗提供了创新策略。

　　

在造血干细胞移植和基因治疗领域，人类造血干细胞（HSC）的体外扩增一直是个重大挑战。现有的培养方法无法完全模拟体内复杂的微环境，导致HSC在体外培养过程中大量丢失，严重限制了临床应用的细胞剂量。虽然近年来在培养条件优化方面取得了进展，如无血清培养基、小分子抑制剂UM171以及化学限定细胞因子免费培养系统的开发，但这些方法主要聚焦于抑制分化或维持细胞静息状态，未能解决培养中HSC死亡的根本原因。

近日发表在《Nature Cell Biology》的一项突破性研究中，由Vijay G. Sankaran领导的团队发现，铁死亡——一种铁依赖性的程序性细胞死亡方式——是导致HSC体外培养损耗的主要机制。通过抑制这一过程，研究人员成功实现了HSC的大规模扩增，为造血干细胞治疗带来了新的希望。

研究人员采用多学科方法验证他们的发现。他们使用来自脐带血和成人动员外周血的CD34⁺造血干细胞，在不同培养系统（包括标准无血清培养和化学限定细胞因子免费培养）中进行实验。通过流式细胞术分析细胞表型和活力，单细胞RNA测序解析细胞状态，脂质组学分析代谢变化，以及体内外功能实验（包括异种移植到NBSGW免疫缺陷小鼠模型和克隆形成 assays）评估干细胞功能。此外，还采用CRISPR-Cas9和碱基编辑技术进行基因组编辑实验。

铁死亡阻断增强不同培养系统中的HSC扩增

研究人员首先在标准无血清培养条件下测试了铁死亡抑制剂的效果。发现使用liproxstatin-1（Lip-1）和ferrostatin-1（Fer-1）处理后，长期造血干细胞（LT-HSC）群体显著扩增，而其他造血祖细胞群体未受影响。这种效果在脐带血和成人来源的HSC中均得到验证，表明铁死亡抑制具有普适性。值得注意的是，在最新开发的化学限定细胞因子免费培养条件下，Lip-1处理使LT-HSC扩增了约50倍，同时短期造血干细胞（ST-HSC）和原始祖细胞也得到扩增。

单细胞转录组分析证实铁死亡抑制富集分子定义的HSC

通过单细胞RNA测序分析，研究人员发现Lip-1处理显著富集了分子定义的HSC群体。细胞组成分析和细胞状态密度比较显示，Lip-1处理组中HSC区室明显扩大。HSC特征基因表达分析进一步证实，铁死亡抑制能够维持HSC的分子特性。

Lip-1增强体内重建能力而不影响造血功能

异种移植实验证明，经Lip-1处理的脐带血来源HSPC在移植后表现出更强的造血重建能力。外周血和骨髓中人CD45⁺细胞比例显著提高，且重建的造血系统包含正常的髓系和淋巴系细胞，无异常造血迹象。次级移植实验进一步证实，Lip-1处理组具有更强的长期重建能力，表明真正的HSC得到了扩增。

成人来源HSPC也受益于铁死亡抑制

在成人动员外周血来源的HSPC中，短期培养后移植同样显示Lip-1处理组具有更高的嵌合率和更原始的祖细胞比例。克隆形成实验表明这些细胞具有更强的增殖分化潜能。

基因组稳定性分析显示无基因毒性风险

深度测序分析覆盖了>95%的克隆性造血相关突变，未发现Lip-1处理诱导体细胞突变或克隆扩增。单细胞RNA测序的拷贝数变异分析也显示无异常染色体变化，表明铁死亡抑制不会增加基因毒性风险。

铁死亡抑制改善基因组编辑HSC的产量

在基因组编辑应用中，Lip-1处理同样显示出显著优势。无论是Cas9介导的基因敲除还是碱基编辑 targeting AAVS1或CD33位点，Lip-1处理都不影响编辑效率，但显著提高了编辑后LT-HSC的产量。在模拟临床治疗镰状细胞贫血的BCL11A增强子编辑实验中，Lip-1处理不仅提高了HSC扩增效率，还在红细胞分化过程中更好地保持了编辑效果，同时不影响胎儿血红蛋白诱导水平。

机制研究揭示铁死亡抑制的多重效应

机制研究表明，Lip-1处理减缓了HSC的增殖速度，但更好地保持了功能性LT-HSC。在分子水平上，铁死亡抑制上调了GPX4表达，降低了脂质过氧化水平。意外的是，转录组分析发现核糖体生物合成和胆固醇代谢通路显著富集。脂质组学分析显示7-脱氢胆固醇（7-DHC）水平升高，这是一种内源性的强效铁死亡抑制剂。直接添加7-DHC也能促进HSC扩增，效果类似于Lip-1。此外，铁死亡抑制还减少了多不饱和脂肪酸磷脂的含量，进一步降低了铁死亡的敏感性。

这项研究的重要意义在于首次明确了铁死亡是人类HSC体外培养损耗的关键机制，并提供了有效的解决策略。铁死亡抑制剂的使用简单易行，可直接整合到现有临床培养 protocols中，无需复杂的技术改造。研究不仅提高了基础科学对HSC生物学特性的认识，更重要的是解决了临床应用中的实际瓶颈问题——细胞剂量不足。特别是在基因组编辑治疗领域，该策略能够显著提高编辑后HSC的产量，为更多患者接受这些创新疗法提供了可能。

研究人员还揭示了HSC在应对培养压力时的代谢适应机制，包括核糖体生物合成增强、胆固醇代谢重编程和磷脂组成改变，这些发现为未来开发更优化的培养策略提供了新的靶点。值得注意的是，这种基于铁死亡抑制的策略在不同细胞来源（脐带血和成人外周血）和不同培养系统（无血清和化学限定条件）中都有效，显示了其广泛的适用性。

总之，这项研究不仅解决了造血干细胞体外扩增的关键难题，也为临床造血干细胞治疗和基因组编辑治疗提供了切实可行的解决方案，有望显著推进这些疗法在更广泛患者群体中的应用。