MultiMap时空动态标记技术揭示EGFR信号转导的邻近蛋白质组学景观

《Nature Chemical Biology》：Temporal photoproximity labeling of ligand-activated EGFR neighborhoods using MultiMap

本研究针对EGFR信号转导过程中动态相互作用的捕捉难题，开发了基于MultiMap的光催化邻近标记技术，通过胞外Flag标签和胞内HaloTag双策略，实现了从不同空间维度对EGF激活后EGFR邻近蛋白质组的分钟级动态追踪。研究成功鉴定到300余个与EGFR激活相关的邻近蛋白，揭示了其在磷酸化、内化、降解及转录调控等不同信号阶段的动态变化，为癌症靶向治疗提供了新思路。

　　

表皮生长因子受体(EGFR)作为细胞生长和分化的重要调控因子，其信号通路的异常激活与多种癌症的发生发展密切相关。尽管针对EGFR的靶向药物如抗体药物西妥昔单抗(cetuximab)和小分子抑制剂已在临床取得一定成效，但肿瘤耐药性和正常组织毒性等问题限制了其应用效果。传统蛋白质相互作用研究技术如免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)难以捕捉膜蛋白在天然环境下的瞬时弱相互作用，而现有邻近标记技术(proximity labeling proteomics, PLP)在时空分辨率方面存在局限。

为解决这一技术瓶颈，加州大学旧金山分校James A. Wells团队在《Nature Chemical Biology》发表了题为"Temporal photoproximity labeling of ligand-activated EGFR neighborhoods using MultiMap"的研究论文。该研究通过创新性地将MultiMap光催化邻近标记平台与基因编码的胞外/胞内标签策略相结合，建立了能够从不同空间维度动态追踪EGFR信号转导过程中邻近蛋白质组变化的技术体系。

关键技术方法包括：1) 基因编码标签策略(Flag标签与HaloTag)实现EGFR胞外域和胞内域的特异性标记；2) MultiMap多尺度光催化标记平台使用曙红Y(eosin Y, EY)催化剂和三种不同标记半径的光探针(芳基-重氮丙啶-生物素、芳基-叠氮-生物素和酚-生物素)；3) 时间分辨的邻近标记实验设计(5分钟至60分钟)；4) 基于质谱的蛋白质组学分析；5) 邻近连接实验(proximity ligation assay, PLA)和基因敲低等功能验证。

Genetically encoded tags for selective live cell labeling

研究人员在A549非小细胞肺癌细胞中构建了N端Flag标签的EGFR(Flag-EGFR)和C端HaloTag标签的EGFR(EGFR-HaloTag)，验证了这些工程化受体在EGF刺激下保持与野生型EGFR相似的磷酸化模式和下游信号激活能力。通过优化2分钟蓝光激活条件，实现了高效且时间可控的蛋白质标记。

EGFR neighborhood changes upon 5-min treatment with EGF

胞外Flag标签MultiMap在EGF刺激5分钟后鉴定到262个显著富集的邻近蛋白，包括已知的EGFR相互作用蛋白如Rab11a、EPS15、ARF6、DNM1等。不同光探针显示出互补的标记特征，芳基-叠氮-生物素探针标记效率最高，而酚-生物素探针具有最长的标记半径。

Changes in EGFR neighborhoods over 60 min of EGF treatment

随着EGF刺激时间延长至60分钟，邻近蛋白数量减少至76个，部分早期相互作用的蛋白(如Rab11a)富集程度下降，而一些晚期相互作用的蛋白(如PTPN6)富集程度增加。基因本体论分析显示这些蛋白主要参与蛋白质定位、囊泡运输等生物过程。

ICD ecto-tag MultiMap maps intracellular neighborhoods

胞内HaloTag MultiMap策略成功鉴定了细胞内特异的EGFR邻近蛋白，包括SHP2、PDLIM5等新发现相互作用蛋白。与胞外策略相比，胞内标记鉴定到的膜蛋白比例显著降低，而参与内核体和转录调控的蛋白比例增加。

EGFR neighbors are associated with EGF-activated functions

通过CRISPR和小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)介导的基因敲低实验，验证了SRC、ARF6、PTPRF等蛋白在EGFR磷酸化调控中的作用，以及Rab11a、EPS15、DNM1等蛋白在内化过程中的功能。此外，STAT3和β-连环蛋白(β-catenin)被证实参与EGFR介导的转录调控。

研究结论表明，时空分辨的MultiMap技术为理解EGFR信号转导的分子机制提供了全新视角。该技术不仅揭示了EGFR信号通路中不同时间阶段的动态相互作用网络，还鉴定了一批潜在的治疗靶点。这种"分子摄影"式的标记方法可推广应用于其他膜受体、突变蛋白和药物作用机制研究，为精准医疗时代的靶向药物开发提供了强有力的技术支撑。