CTCF与黏连蛋白在基因调控中的结构与功能角色解析：揭示三维基因组组织与转录控制的新机制

《Nature Genetics》：Disentangling the architectural and non-architectural functions of CTCF and cohesin in gene regulation

本研究针对CTCF和黏连蛋白在三维基因组结构组建和基因调控中的具体功能机制这一长期争议问题，通过在小鼠胚胎干细胞中急性降解RAD21或CTCF，结合EU-seq、ChIP-seq等高通量技术，系统阐明了黏连蛋白主要通过促进CBP/p300依赖的增强子-启动子互作来激活基因表达，而CTCF除锚定染色质环外，还能以位置和方向依赖的方式直接调控转录。研究发现CTCF的C端结构域对其非结构功能至关重要，其脊椎动物特异性旁系同源物CTCFL虽不能锚定黏连蛋白环，但可替代CTCF发挥转录激活功能。该研究为理解CTCF/黏连蛋白在增强子依赖和非依赖的转录调控中的双重作用提供了统一模型。

　　

在真核生物细胞核内，长约2米的DNA如何有序折叠并精确调控基因表达，一直是生命科学的核心问题。黏连蛋白（cohesin）和CTCF作为基因组三维结构的关键组织者，可通过形成染色质环（chromatin looping）和拓扑关联结构域（TADs），facilitate增强子-启动子（E-P）互作。然而，这些环状结构对全局基因调控的具体贡献程度，以及CTCF除作为结构锚定点外是否直接参与转录调控，长期存在争议。早期研究表明，急性去除CTCF或黏连蛋白仅引起有限数量的基因表达变化，这与它们在全基因组范围内广泛分布的结合模式形成鲜明对比。此外，CTCF在脊椎动物中不可或缺，但在果蝇等生物中却非必需，这种进化上的差异暗示其可能具有尚未揭示的生理功能。这些悬而未决的问题促使研究人员深入探索CTCF和黏连蛋白在基因调控中更深层次的作用机制。

为了回答这些问题，研究人员利用小鼠胚胎干细胞（mESC）模型，通过auxin诱导降解系统急性去除RAD21（黏连蛋白核心亚基）或CTCF，并采用5-乙炔尿苷（5-EU）标记新生RNA测序（EU-seq）技术，精确捕捉转录组的早期变化。研究发现，急性去除RAD21或CTCF实际上会影响数百个基因的表达，颠覆了之前认为影响范围有限的看法。其中，黏连蛋白的缺失主要导致依赖CBP/p300的增强子靶基因下调，而CTCF的缺失则对基因表达有更复杂的影响，既可激活也可抑制，且与其在启动子区域的结合位置和方向密切相关。

本研究的关键技术方法包括：利用降解标签（degron-tag）系统在小鼠胚胎干细胞（mESC）和由其分化得到的神经前体细胞（NPC）中实现RAD21、CTCF及其突变体（CTCF^Y226A/F228A，简称CTCF^YF-AA）的快速降解；通过新生RNA标记测序（EU-seq）分析急性降解处理后的转录组变化；运用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）评估转录因子结合、RNA聚合酶II（Pol II）占据及染色质可及性的动态变化；并通过荧光素酶报告基因实验验证CTCF对启动子的直接调控功能。

Cohesin regulates many genes, albeit subtly

研究人员发现，虽然急性去除RAD21后，达到传统统计学显著差异的基因数量有限，但采用更宽松的倍数变化标准并结合大量生物学重复验证后，证实有超过300个基因出现1.3至3倍的下调。这些受黏连蛋白下调的基因（RAD21^down）显著富集于那些同样被CBP/p300抑制剂A-485下调的基因，且下调程度越强的基因，对CBP/p300的依赖性也越高。在分化的神经前体细胞（NPCs）中，也观察到类似现象，表明黏连蛋白通过CBP/p300依赖的增强子激活基因是一个普遍机制。

RAD21-and CTCF-regulated genes differ in CBP/p300 dependency

与黏连蛋白不同，CTCF调控的基因对CBP/p300的依赖性呈现异质性。只有一部分CTCF下调基因（CTCF^down）与A-485下调基因重叠，且这部分基因通常对CTCF的依赖性较弱。相反，那些最依赖CTCF的强下调基因（如HD类）反而较少依赖于CBP/p300，提示CTCF存在不依赖于增强子的调控机制。

Limited overlap between RAD21-and CTCF-regulated genes

RAD21和CTCF缺失所引起的转录组变化相关性较弱（PCC=0.18），且两者调控的基因集合重叠有限。然而，在少数同时被两者下调的基因中，有93%也受CBP/p300调控，表明这部分基因是黏连蛋白-CTCF环结构与CBP/p300功能共同作用的关键节点。

RAD21-and CTCF-regulated genes differ in enhancer proximity

基因组学分析显示，RAD21下调基因附近50kb范围内显著富集H3K27ac和H2BK20ac标记的候选增强子。而被CTCF和A-485共同下调的基因（CTCF^downA-485^down）附近也存在增强子，但仅被CTCF下调（CTCF^downA-485^ND）的基因附近则增强子信号很弱，进一步支持CTCF存在增强子依赖和非依赖两种调控模式。

CTCF-regulated genes exhibit strong CTCF promoter binding

CTCF在启动子近端区域（转录起始位点TSS±2kb）的结合，尤其是核心启动子区（TSS±200bp）的结合，与CTCF依赖的基因调控密切相关。在CTCF^down和CTCF^up基因的启动子区域，CTCF结合频率和强度都显著高于RAD21下调基因或A-485下调基因。

Promoter-bound CTCF activates genes without cohesin

为了区分CTCF的结构功能和非结构功能，研究人员构建了CTCF^YF-AA点突变mESC系，该突变体（Y226A/F228A）无法锚定黏连蛋白环。研究发现，急性降解CTCF^YF-AA仍能导致大量基因下调，其中86%的强下调基因与野生型CTCF降解后的下调基因重叠。这部分基因大多不依赖于A-485，且其启动子区域有CTCF结合，证明CTCF本身具有不依赖于黏连蛋白环的直接转录激活功能。

CTCF's non-architectural functions depend on its C terminus

通过构建N端或C端截短的CTCF降解细胞系，研究人员发现CTCF的转录激活和抑制功能主要依赖于其C端结构域。去除C端结构域的CTCF（dTAG CTCF^ΔC）其降解不再影响那些依赖CTCF直接激活功能的基因表达，而去除N端结构域的CTCF（bTAG ΔNCTCF）其降解仍然引起这些基因的下调，证明C端对CTCF的非结构功能至关重要。

CTCF controls chromatin accessibility

ATAC-seq分析显示，急性降解CTCF 3小时后，全基因组范围内染色质可及性主要呈现降低趋势，尤其在CTCF结合位点。在CTCF^down基因的启动子区域，可及性显著降低，且降低程度与CTCF的结合强度相关。

CTCF binding position and orientation dictate its functions

深入分析发现，CTCF的调控功能与其在启动子区域的结合位置和方向密切相关。当CTCF以正向（forward）方向结合在TSS紧上游（如-79bp中位值）时，主要发挥转录激活作用。当其结合在TSS更上游时，可能抑制上游反义转录（uasTrx）；而当其结合在核心启动子区内或TSS下游时，则可能抑制正义转录。

研究结论和讨论部分系统整合了上述发现，强调了其重要意义。本研究成功解析了黏连蛋白和CTCF在基因调控中既相互关联又彼此独立的功能。黏连蛋白主要通过促进CBP/p300依赖的增强子-启动子环化来激活基因表达，而CTCF则具有双重角色：一方面作为黏连蛋白的锚定点协助三维基因组组建（结构功能），另一方面直接作为转录因子调控基因表达（非结构功能）。CTCF的非结构功能尤其依赖于其C端结构域，并且其脊椎动物特异性旁系同源物CTCFL（BORIS）可以替代CTCF发挥转录激活作用，这为理解CTCFL在癌症等疾病中异常表达的后果提供了新视角。该研究还揭示了CTCF调控的多样性由其结合位置和方向决定，这解释了为何哺乳动物CTCF是细胞增殖所必需，而果蝇CTCF则非必需——因为哺乳动物CTCF承担了直接激活持家基因这一关键功能。这些发现为全面理解三维基因组结构与转录调控的耦合机制提供了统一模型，对认识发育、疾病相关的基因表达失调具有重要启示。