SeqForge：面向宏基因组数据集的可扩展比对搜索与序列挖掘平台

《BMC Bioinformatics》：SeqForge: a scalable platform for alignment-based searches, motif detection, and sequence curation across meta/genomic datasets

本文推荐研究人员开发了SeqForge——一个模块化命令行工具包，旨在解决微生物和宏基因组数据激增背景下大规模定制化比对搜索和功能注释的瓶颈。该平台自动化BLAST+数据库构建与查询流程，整合氨基酸模体挖掘功能，支持并行化计算，可将结果整理为结构化格式。测试表明其在高性能计算环境中保持近线性运行时缩放和适度内存使用，为种群水平基因组比较研究提供了低计算门槛的解决方案。

　　

随着高通量测序技术的飞速发展，微生物基因组和宏基因组组装数据正以每年数千个的速度涌入公共数据库。这一数据洪流为大规模比较分析、基因组挖掘计划和揭示新生物学见解的元研究提供了前所未有的机遇。然而，如何有效利用这些海量数据，成为摆在研究人员面前的一大挑战。种群水平的搜索——例如泛基因组探索、生物合成基因簇（BGC）发现和抗菌素耐药性基因调查——对于将基因组多样性与生态或临床结果以及药物发现和开发联系起来变得越来越重要。尽管需求迫切，但现有的生物信息学平台存在明显局限。

目前，虽然已有众多工具支持基因组分体的特定环节，如质量评估（QUAST、CheckM）、系统基因组学分析（PhyloPhlAn、RAxML）、注释框架（Anvi'o、eggNOG-mapper）以及生物合成基因簇发现平台（antiSMASH、PRISM），但它们都未能直接解决探索性宏基因组学中的一个核心需求：跨大型基因组集合的可扩展、可定制化比对搜索。NCBI BLAST+因其鲁棒性、速度和多功能性，仍然是序列比对和探索性基因组 interrogation 最广泛使用的工具。然而，使用BLAST+进行种群规模研究通常需要借助Bash、Python等语言编写定制脚本，以自动化迭代的数据库创建和查询执行。对于许多缺乏计算训练的研究人员而言，这构成了显著障碍。此外，标准的BLAST+工作流程会为每个查询-数据库比较生成独立的输出文件，即使对于中等规模的数据集，下游的组织、解析和解释也变得繁琐不堪。

为了应对这些挑战，犹他大学的研究人员开发了SeqForge。这是一个可扩展的命令行工具包，旨在简化大规模基因组探索。SeqForge自动化了BLAST+工作流程的关键组件，简化了种群规模数据集的管理，并增加了氨基酸模体（Motif）发现、序列提取和有组织的成果整理功能。通过在现有管道和用户友好的探索性搜索工具之间架起桥梁，SeqForge降低了宏基因组研究的计算门槛，加速了对大型基因组集合的 interrogation。

关键技术方法概述

SeqForge采用Python（≥3.10）开发，其核心包括基因组搜索、序列调查和实用工具三大模块，通过统一入口点调用。平台自动化处理多种格式的FASTA输入（包括压缩文件），利用并发技术实现多核并行计算，显著提升了BLAST+数据库构建、查询和序列提取等计算密集型任务的效率。其特色功能包括：基于正则表达式的氨基酸模体挖掘（支持通配符X）、与BLAST结果关联的可视化（热图、序列标识图）、根据比对坐标精确提取序列或完整重叠群（contig）、以及轻量级的元数据提取和组装质量评估。

研究结果

平台架构与工作流程

SeqForge采用模块化设计，通过统一的命令行界面（seqforge ）访问所有功能。其核心工作流程始于创建BLAST数据库库（makedb命令）。平台具备智能文件名净化功能，可自动处理与BLAST+架构不兼容的特殊字符。随后，用户可使用查询模块（query命令）运行任意数量的查询序列 against 任意数量的数据库。SeqForge能自动检测数据库类型（核酸或蛋白）并调用相应的BLAST程序（blastn, blastp, tblastn），默认使用90%同一性、75%查询覆盖度和E值1x10^-5的阈值，且这些参数均可调整。

性能基准测试

基准测试评估了makedb、query、extract/extract-contig模块的运行时间缩放、内存需求和并行化效率。测试使用了两个代表性数据集：一个包含500个大肠杆菌基因组和20个基因查询的“笔记本电脑规模”数据集，以及一个包含2,157个大肠杆菌基因组和50个基因查询的“种群规模”数据集。结果表明，在所有模块中，SeqForge随着线程数的增加表现出高效的缩放。例如，在500个基因组、20个查询的情况下，查询执行时间从使用1个线程时的32分33秒减少到使用16个线程时的2分钟。在2,157个基因组、50个查询的大规模数据集上，运行时间从使用8个线程时的57分57秒减少到使用48个线程时的15分15秒。内存使用方面，makedb模块需求较低（峰值RSS ≤82 MB），query模块需求中等（峰值RSS ≤901 MB）。序列提取（extract）在超过16个线程后显示出略微递减的回报，可能部分受I/O限制，但仍保持高效。相比之下，提取完整重叠群（extract-contig）由于工作负载主要由顺序文件读写主导，显示出的加速效果最小。总体而言，SeqForge保持了适度的每线程内存使用，为计算密集型模块提供了高效的缩放，即使对于I/O繁重的工作流程也能提供快速的性能。

模体挖掘功能验证

为展示SeqForge的模体挖掘能力，研究团队在一个特征明确的生物合成基因簇——红霉素BGC（MIBiG accession: BGC0000055.5）中进行了靶向搜索，寻找与酰基转移酶（AT）、酮合酶（KS）和酮还原酶（KR）活性相关的域水平模体。通过使用特定的模体搜索字符串（如--motif RVXXXQ{AT} GHXXGE{AT} ...），SeqForge成功在所有相关模块中检测到预期的AT、KS和KR模体，结果以结构化表格形式输出。这些结果与先前表征的每个生物合成模块的酶功能相一致，验证了模体挖掘作为BGC功能注释补充工具的实用性。

案例研究：在青霉属中检测潜在的铜依赖性卤化酶

为展示SeqForge的更广泛效用，研究团队将完整流程应用于一个未特征化的真菌种群。案例研究选择了ApnU——一个来自产草酸青霉114-2 atpenin B BGC（MIBiG accession: BGC0002067.3）的新近表征的铜依赖性卤化酶。研究人员从NCBI Datasets策展了549个公开可用的青霉属基因组数据集，使用seqforge makedb将其转换为BLAST数据库。随后使用ApnU氨基酸序列作为输入，以≥80%同一性和≥70%查询覆盖度的宽松阈值进行翻译核苷酸搜索（seqforge query）。14个命中结果符合标准并被保留用于下游分析。

通过seqforge extract提取每个命中点及其侧翼序列（上游50 kb，下游30 kb）后，使用在高质量产黄青霉IBT 35668基因组（GCA_028827035.1）上训练的AUGUSTUS预测编码序列（CDS）。SeqForge的模体挖掘实用程序在这些预测的蛋白质数据库中进行分析，在每个案例中均准确识别出两个HXXHC模体，与ApnU的铜结合残基一致。为确认这些基因组区域编码atpenin B样基因簇，将每个序列及其GFF3文件提交至antiSMASH的真菌管道进行分析。所有14个区域均显示出与特征化atpenin B基因簇的中等到高度相似性。通过CAGECAT的Clinker比对揭示了所有命中点之间强大的同线性和高基因同一性。

结论与意义

SeqForge填补了小型BLAST+搜索与种群规模挖掘之间的实用空白，提供了一个模块化命令行界面，自动化了数据库构建、高通量查询、模体发现以及下游提取和可视化。与泛基因组管道、HMM中心分析器或通用QC/格式化工具包相比，SeqForge在保留NCBI BLAST+可解释性和普遍性的同时，增加了可扩展性、统一输出以及平滑常见压力点的实用程序（如文件名净化、标头去重复和轻量级组装指标）。这种设计降低了探索性宏基因组分析的门槛。

尽管SeqForge解决了当前可用软件的明显差距，但它也存在一些局限性。结果仍然对BLAST阈值和数据库质量敏感。宽松的设置可能增加对易泛滥基因家族的假阳性，而过于严格的截断值可能会排除 divergent 同源物。动态查询，例如使用多个代表性序列或在多次运行中改变包含阈值，有助于平衡这些权衡并加强结果数据集。同样，基于正则表达式的模体搜索虽然快速、透明且非常适合高度保守的模体，但可能会忽略那些使用配置文件或HMM可能更有效捕获的含有空位或简并的变体。

总之，SeqForge通过将多查询BLAST搜索和模体挖掘功能集成到简化的工作流程中，减少了对定制脚本的需求，最大限度地减少了手动整理，并加速了保守功能模体的识别。其模块化设计和对多核执行的支持使其同样适用于个人计算机上的小规模分析和高性能计算集群上的高通量筛选。作为一个免费可用的工具，SeqForge可适应广泛的基因组挖掘应用，有助于从日益增长的公共可用基因组数据集财富中加速发现进程。