定量微生物组分析揭示动物尸体分解过程中细菌与真菌群落的绝对丰度动态及功能贡献

《npj Biofilms and Microbiomes》：Quantifying the relative contributions of bacterial and fungal communities to carcass decomposition using a quantitative microbiome profiling approach

本研究针对动物尸体分解过程中微生物绝对丰度动态不清的问题，采用定量微生物组分析(QMP)和代谢组学技术，系统揭示了细菌和真菌在分解过程中的协同作用。研究发现QMP与相对微生物组分析(RMP)呈现显著不同的演替模式，细菌在代谢物变化中起主导作用，且关键分解菌形成协同模块共同驱动有机质降解。该研究为理解尸体分解的微生物生态过程提供了新视角。

　　

在自然界中，动物尸体的分解是一个至关重要的生态过程，它通过释放碳、氮等营养元素影响着土壤肥力和生态系统功能。然而，与植物凋落物分解研究相比，人们对动物尸体分解过程中微生物的动态变化及其功能知之甚少。动物尸体富含蛋白质和脂质，其分解会产生胺类、苯系物等特殊代谢物，这使得分解微生物群落与降解植物凋落物的群落截然不同。尽管研究表明动物尸体中约20%的碳和2-3%的氮会释放到环境中，但驱动这一过程的微生物机制仍不明确。

以往研究多采用高通量测序技术监测微生物群落组成和相对丰度变化，特别是在法医学中用于死后间隔(PMI)估计。例如，Metcalf等人通过分析小鼠尸体微生物群落建立了PMI预测模型，Liu等人结合微生物数据和人工神经网络将PMI预测精度提高到约14.5小时。然而，这些研究主要关注微生物演替与PMI的建模关系，未能揭示微生物群落的代谢活性及其在生物地球化学循环中的作用。更重要的是，相对丰度测量无法反映微生物的绝对数量变化，可能导致对微生物生态角色的误解。

近期研究表明，定量微生物组分析(QMP)能够校正相对微生物组分析(RMP)的偏差，提供更准确的微生物动态信息。例如，Tkacz等人证明，某些类群在相对丰度下降的同时，其绝对数量可能实际增加。然而，在尸体分解研究中，尚未有基于绝对分类丰度的微生物演替综合分析，这限制了对微生物类群在分解和营养循环中功能贡献的理解。

针对这一空白，山西医科大学法医学院的研究团队在《npj Biofilms and Microbiomes》上发表了一项创新研究。该研究采用QMP方法，结合代谢组学分析，系统研究了Sprague-Dawley(SD)大鼠尸体分解过程中细菌和真菌群落的演替规律。通过比较QMP与RMP的差异，识别关键微生物分解者，并分析微生物与代谢物的关联，旨在更全面理解尸体分解的微生物代谢过程和营养通量。

主要技术方法

研究使用42只SD大鼠(雌雄各半)建立尸体分解模型，在埋葬后第1、3、7、14、21、28和35天采集常规土壤、墓穴土壤和组织样本。DNA提取时加入已知拷贝数的合成内标序列，通过16S rRNA基因(V4-V5区)和ITS2区测序分析细菌和真菌群落，基于内标标准曲线计算微生物绝对拷贝数。非靶向代谢组学采用UHPLC-MS/MS技术分析组织代谢物。数据分析包括微生物多样性分析、时间衰减模型、共现网络构建，以及微生物与代谢物的Procrustes分析、Mantel检验和随机森林模型。

微生物群落的丰度和多样性变化

研究发现，在整个研究期间，每克样本中细菌16S rRNA基因的拷贝数始终高于真菌ITS基因。常规土壤样本中微生物拷贝数保持稳定，而组织样本波动最为显著。死后14天内，细菌和真菌群落均快速增殖，之后细菌生长放缓，真菌数量下降。墓穴土壤微生物拷贝数初期与常规土壤相当，但呈现先升后降趋势。

α多样性分析显示，常规土壤细菌群落相对稳定，真菌α多样性逐渐下降。墓穴土壤中细菌和真菌α多样性均呈下降趋势。组织样本中两者α多样性在前期下降，14天后部分恢复。主坐标分析(PCoA)表明墓穴土壤和组织样本的微生物群落具有明显不同的演替模式，且随分解进程呈现规律性变化。

研究鉴定出14个细菌属和10个真菌属为组织中的关键分解者，这些类群与PMI呈显著正相关。

RMP与QMP方法在微生物演替和相互作用分析中的比较

在门和属水平上，QMP和RMP显示出显著不同的微生物演替模式。例如，基于RMP，Pseudomonadota在组织样本中呈下降趋势，而QMP显示为上升趋势。Ascomycota在RMP中先降后升，QMP则呈现相反趋势。类似矛盾也出现在Actinobacteriota和Basidiomycota的分析中。

Wilcoxon秩和检验发现，在墓穴土壤和组织样本中，分别有21个细菌属/31个真菌属和69个细菌属/15个真菌属在QMP和RMP中呈现相反趋势。时间衰减模型显示，两种方法均发现微生物群落与PMI存在显著线性时间衰减关系，但组织样本中细菌和真菌群落的演替速率在QMP中更高。

共现网络分析表明，RMP显著高估了微生物间相关性：组织中仅3.96%的细菌相关性和12.89%的真菌相关性在QMP中得到验证。墓穴土壤中重叠比例较高(细菌53.88%，真菌40.48%)，表明微生物负荷变化越大，QMP与RMP差异越明显。

尸体分解过程中代谢物丰度变化

非靶向代谢组学鉴定出2614个代谢特征，其中576、934和397个代谢物分别被KEGG、HMDB和LIPID MAPS数据库注释。主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)显示样本按PMI分组，前7天与14天后的样本代谢谱差异显著。L-半胱氨酸-S-硫酸酯、吲哚-3-乳酸和烟酰胺是主要区分代谢物。

Spearman相关分析发现557个代谢物与PMI显著相关，其中313个(簇1)负相关，244个(簇2)正相关。簇1中以有机酸及其衍生物为主(18.53%)，簇2中脂质和类脂分子占40.57%。

微生物与代谢物的关联

Procrustes分析显示微生物群落与代谢物密切相关(细菌：r=0.881；真菌：r=0.842)。Mantel检验表明细菌群落与代谢物的独立相关性(r=0.660)强于真菌群落(r=0.019)。冗余分析(RDA)发现16S rRNA和ITS基因拷贝数、α多样性以及三个细菌门和四个真菌门是代谢物变异的重要贡献者，其中Pseudomonadota影响最为显著。

随机森林模型识别出与微生物丰度最相关的代谢物：细菌群落主要与吡啶类、苯并吡喃类和嘧啶核苷类相关，真菌群落主要与内酰胺类、四环素类和四氢异喹啉类相关。10个代谢物类别同时与细菌和真菌群落高度相关，表明在分解过程中存在协同互作。

共现网络分析进一步揭示了微生物间的模块化互作结构。网络包含225个节点(170个细菌属，55个真菌属)和664条边，模块性为0.52。关键微生物分解者分布在模块1和3中，这两个模块与54个代谢物类别显著相关，表明细菌和真菌分解者在有机质降解中存在协同关系。

基于随机森林模型的PMI预测

基于扩增子序列变异(ASV)水平的QMP、RMP和代谢物数据构建随机森林PMI预测模型。结果显示，使用最优生物标志物的模型误差较低。QMP和RMP数据的平均绝对误差(MAE)相当，组织样本中细菌QMP数据预测最准确。代谢物数据的PMI预测误差(测试集：1.96±1.52)低于微生物数据，而多组学数据整合后预测最准确(测试集：MAE=1.53±1.37)。

研究结论与意义

该研究通过QMP方法揭示了尸体分解过程中细菌和真菌群落的绝对丰度动态，填补了微生物绝对定量分析在分解生态学研究中的空白。研究发现QMP与RMP在阐释微生物演替和相互作用方面存在显著差异，强调在微生物负荷波动大的生态过程中采用QMP的重要性。

研究证实细菌在尸体分解的代谢物变化中起主导作用，这可能源于细菌对富营养基质的高效利用能力。同时，细菌和真菌通过形成互作模块协同降解有机质，这种功能分区和交叉喂养机制促进了分解效率。

尽管用QMP替代RMP并未显著提高PMI预测精度，但多组学数据整合可略微提升模型性能。考虑到QMP的成本较高，研究者建议在PMI预测应用中可继续使用RMP方法。

该研究为理解尸体分解的微生物生态过程提供了新视角，强调了定量微生物组分析在准确解析微生物动态方面的价值。未来研究需结合稳定同位素示踪等技术，验证微生物与代谢物的因果关系，并考虑环境变量对微生物分解过程的影响。