Pannexin 1通过下调APOBEC2诱导横纹肌肉瘤细胞融合的机制研究

《Oncogenesis》：Pannexin 1 induces Rhabdomyosarcoma cell fusion by downregulating APOBEC2

本研究针对横纹肌肉瘤(RMS)分化受阻的难题，探讨了Pannexin 1(PANX1)通过下调APOBEC2表达促进肿瘤细胞融合的新机制。研究人员通过多种RMS细胞系和肿瘤标本发现，PANX1过表达能显著降低APOBEC2水平，诱导多核化现象，证实这种多核化源于细胞融合。特别值得注意的是，在过表达APOBEC2的RMS细胞中，PANX1仍能抑制肿瘤增殖和存活，但失去了促进细胞融合的能力。这项发表于《Oncogenesis》的研究为通过诱导分化治疗RMS提供了新的靶点和理论依据。

　　

在儿童软组织肉瘤中，横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma, RMS)是最常见的恶性类型，尤其好发于婴幼儿和青少年。这种肿瘤被认为起源于肌生成(myogenesis)过程受阻的肌源性前体细胞。尽管RMS细胞表达肌源性标志物，但它们无法正常退出细胞周期完成分化和融合，最终导致恶性增殖。目前对于转移性或复发性RMS患者，5年生存率分别仅为30%和17%，开发新的治疗策略迫在眉睫。

传统上，促进肿瘤细胞分化被视为一种有前景的抗癌策略。在正常肌生成过程中，单核肌母细胞分化后相互融合形成多核肌管，最终发育成熟为肌纤维。这一过程一旦完成，细胞就失去了增殖和迁移能力。因此，如果能够"说服"RMS细胞继续完成它们未完成的肌生成程序，就有可能抑制肿瘤生长和转移。

在这项发表于《Oncogenesis》的研究中，研究人员将目光投向了Pannexin 1(PANX1)这一蛋白。PANX1是一种形成单膜通道的蛋白，在细胞通讯和信号传导中发挥重要作用。先前的研究表明，PANX1在骨骼肌中表达，并且在肌生成过程中表达量逐渐上升，提示它可能参与调控肌细胞分化。有趣的是，与正常肌细胞相比，RMS组织和细胞系中PANX1表达水平显著降低，特别是在RMS细胞中，PANX1转录本的5'非翻译区(5'UTR)完全丢失，导致无法正常翻译。

研究团队此前发现，过表达PANX1能够抑制RMS的恶性特性，且这一作用不依赖于其经典的通道活性。通过RNA测序(RNA-seq)分析，他们发现PANX1过表达能显著改变RMS细胞的转录组景观，其中APOBEC2(载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基2)的表达被明显下调。APOBEC2在骨骼肌中高表达，影响肌肉发育，但其在RMS中的作用尚不清楚。

为了探究PANX1是否通过调控APOBEC2来影响RMS细胞行为，研究人员进行了一系列实验。他们首先检测了APOBEC2在RMS中的表达模式，然后研究了PANX1过表达对APOBEC2的调控作用，最后探讨了这种调控对RMS细胞生物学行为的影响。

研究采用的主要技术方法包括：使用患者来源的RMS细胞系和肿瘤标本进行实验；通过慢病毒载体构建稳定过表达PANX1和APOBEC2的细胞系；采用蛋白质印迹(Western blot)、实时定量PCR(RT-qPCR)和免疫荧光技术检测蛋白和基因表达；通过细胞核计数和细胞融合实验评估多核化现象；利用细胞增殖、活性和3D肿瘤球体培养等功能实验评估肿瘤恶性特性。

APOBEC2在RMS中的表达特征

研究人员首先检测了六种患者来源的RMS细胞系中APOBEC2的表达情况，并与未分化和分化中的人骨骼肌肌母细胞(HSMM)进行比较。结果显示，大多数RMS细胞系的APOBEC2转录水平与未分化HSMM相当，但显著低于分化中的HSMM。

在蛋白水平上也观察到类似趋势。免疫荧光分析显示，APOBEC2在肌母细胞和RMS细胞中主要定位于细胞质，但在Rh36和RD细胞系中，APOBEC2可能定位在高尔基体和内质网等细胞器。对9例儿科RMS肿瘤和7例骨骼肌活检组织的分析进一步证实，APOBEC2在RMS肿瘤中的表达水平低于正常骨骼肌。

PANX1过表达导致APOBEC2下调

研究人员在稳定的RMS细胞系中使用可诱导的PANX1过表达系统，评估了PANX1对APOBEC2表达的调控作用。发现在培养过程中，大多数对照细胞中的APOBEC2水平随着细胞增殖而增加，而在Rh28、Rh30和RD细胞中，PANX1过表达显著降低了APOBEC2的表达。

这种下调在培养约四天后开始明显，八天后更加显著。在mRNA水平上也观察到类似变化，表明PANX1在转录水平调控APOBEC2表达。此外，在Rh30异种移植瘤模型中，PANX1过表达同样导致APOBEC2水平下降，证实这一调控在体内也能发生。

PANX1调控APOBEC2不依赖于Pax7

由于先前研究表明Pax7下调会导致APOBEC2表达减少，研究人员检测了PANX1过表达是否影响Pax7表达。结果显示，虽然不同RMS细胞系中Pax7阳性细胞的比例存在差异，但PANX1过表达并不影响Pax7的表达水平，表明PANX1调控APOBEC2不依赖于Pax7通路。

PANX1诱导多核化与细胞融合

研究人员发现，PANX1过表达在Rh28、Rh30和RD细胞中显著增加多核细胞比例和融合指数，而在Rh41、Rh36和Rh18细胞中无此效应。值得注意的是，PANX1能够诱导多核化的细胞系正是那些APOBEC2被下调的细胞系。

为了确认多核化是否源于细胞融合，研究人员构建了分别带有红色和绿色细胞核的Rh30细胞系，将它们共培养后过表达PANX1。结果显示，多核细胞中同时存在红色和绿色标记的细胞核，证实多核化确实由细胞融合引起。

APOBEC2过表达对PANX1功能的影响

为了明确APOBEC2下调在PANX1介导的抗肿瘤效应中的作用，研究人员构建了同时过表达PANX1和APOBEC2的Rh30细胞系。结果显示，APOBEC2过表达并不影响PANX1对细胞增殖、活性和3D肿瘤球体生长的抑制作用。

然而，APOBEC2过表达完全阻断了PANX1诱导的细胞多核化和融合。在未过表达PANX1的情况下，APOBEC2过表达本身还能促进Rh30肿瘤球体生长，提示APOBEC2可能支持RMS的干细胞样特性。

研究结论与意义

本研究首次系统探讨了APOBEC2在RMS中的作用，揭示了PANX1通过下调APOBEC2表达促进RMS细胞融合的新机制。研究发现APOBEC2在RMS中表达水平低于正常肌组织，且在细胞增殖过程中表达增加，可能有助于维持肿瘤细胞的干细胞样特性。PANX1过表达能在部分RMS细胞系中下调APOBEC2，并诱导细胞融合，而这一效应可被APOBEC2过表达所逆转。

值得注意的是，PANX1对RMS细胞增殖和存活的抑制作用不依赖于APOBEC2下调，表明PANX1通过多条下游通路发挥其抗肿瘤效应。这种多靶点作用机制使PANX1成为一个有前景的治疗靶点。

从转化医学角度看，这项研究为诱导分化治疗RMS提供了新的思路。通过提高PANX1表达或抑制APOBEC2活性，可能迫使RMS细胞继续完成肌生成程序，从而抑制其恶性表现。研究人员此前已发现槲皮素(quercetin)能显著提高RMS细胞中PANX1水平，并诱导细胞分化，这为开发新的治疗策略提供了候选化合物。

总之，这项研究不仅深化了我们对RMS发病机制的理解，也为开发新的分化治疗策略提供了理论依据和实验证据。通过调控PANX1-APOBEC2轴促使肿瘤细胞分化融合，可能成为未来RMS治疗的新方向。