提高新大陆螺旋蝇条件雌性致死系统的性别特异性：增强遗传生物防治效力的新策略

《Scientific Reports》：Improving the sex-specificity of a conditional female lethal system for genetic biocontrol of the New World screwworm, Cochliomyia hominivorax

本研究针对新大陆螺旋蝇防治中雌雄同释降低不育昆虫技术(SIT)效率的问题，开发了基于tetO/tTAv系统的转基因性别筛选品系。通过利用Chhalo和g6451胚胎特异性启动子驱动雌性特异性tTAv表达，成功构建了DR9和DR10品系，其中DR10#4-3xEF1#6品系在保持雄性竞争力的同时实现了晚期雌性致死，为雄性不育释放计划提供了优化方案。

　　

在美洲大陆的畜牧业中，一种名为新大陆螺旋蝇（Cochliomyia hominivorax）的专性寄生蝇长期肆虐，其幼虫会侵入温血动物的伤口造成严重感染，导致牲畜生产力下降甚至死亡。虽然美国通过不育昆虫技术(Sterile Insect Technique, SIT)成功根除了这一害虫，但该技术需要同时释放不育雄蝇和雌蝇，而雌蝇会与野生雌蝇竞争交配，反而降低了防治效率。因此，开发只释放雄蝇的遗传防治策略成为当务之急。

传统的SIT技术面临的最大挑战之一是如何在大规模饲养过程中早期清除雌性个体，从而节省幼虫饲料成本。此前研究人员已经开发出条件雌性致死遗传系统，利用四环素转录激活因子(tetracycline transactivator, tTA)系统，在缺乏四环素的情况下诱导雌性死亡。然而，这些早期系统存在两个主要缺陷：雌性死亡发生在幼虫后期或蛹期，未能实现早期饲料成本节约；同时转基因雄性的适应度较低，影响了野外竞争能力。

针对这些挑战，Aidamalia Vargas Lowman等研究人员在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果，旨在通过改进tTA系统的性别特异性表达，提高遗传防治品系的性能。他们假设，此前观察到的雄性适应度下降可能是由于tTA在雄蝇中也有表达，因此设计了一种新策略：让tTA的驱动和效应组件都实现雌性特异性表达。

研究团队选择了两个在早期胚胎(0-1小时)中特异性表达的基因启动子——Chhalo和g6451，构建了DR9和DR10两种转基因驱动品系。这些品系的特点是tTAv（经过优化的tTA变体）编码区插入了新大陆螺旋蝇转化因子(transformer, Chtra)基因的性别特异性内含子，确保只有雌性能够产生有功能的tTA蛋白。

分子分析证实，tTAv转录本确实发生了预期的性别特异性剪接。令人意外的是，研究还发现g6451基因的5'UTR中存在一个未被注释的额外内含子。表达谱分析显示，Chhalo启动子主要在原胚期活跃，后期表达有限，且不在卵巢中表达，这使其非常适合用于早期雌性致死系统。相比之下，g6451启动子在各个发育阶段都有活性，包括卵巢表达，这表明存在母体沉积现象，与之前RNAseq数据的预期不符。

研究人员将DR9和DR10驱动品系与EF1#6效应品系杂交，获得了双纯合(double homozygous, DH)品系，并在含有25μg/mL多西环素（四环素的替代物，具有更高生物利用度）的饲料中维持这些品系。为了测试雌性致死效果，他们比较了标准喂养方案（仅从亲代成虫饲料和子代幼虫饲料中去除多西环素）和改良喂养方案（额外从亲代三龄幼虫饲料中去除多西环素）。

研究结果显示，在标准喂养方案下，DR9品系主要产生雄蝇，但雌性致死发生在幼虫后期或蛹期。而在改良喂养方案下，雌性致死提前到早期发育阶段，更接近研究目标。这表明亲代三龄幼虫摄入的多西环素可能通过母体传递抑制了胚胎期的雌性致死系统。

性别比例分析证实了这些品系的雌性特异性致死效果。在含多西环素的饲料中，所有DH品系产生等量的雄蝇和雌蝇。而在不含多西环素的情况下，DR9#3-2BxEF1#6和DR10#4-3xEF1#6品系主要产生雄蝇，DR10#5AxEF1#6品系则只产生雄蝇。未羽化蛹的比例较高表明某些品系中雌性死亡发生在蛹期。

雄性适应度评估显示了混合结果。交配成功率测试中，DR9#3-2BxEF1#6和DR10#4-3xEF1#6品系的雄性与J-06雄蝇相当，而另外两个品系的雄性则表现较差。竞争性交配实验中，DR10#4-3xEF1#6品系雄蝇在任何多西环素喂养方案下都与J-06雄蝇完全竞争，而其他品系雄蝇则被J-06雄蝇超越。寿命方面，除DR9#3-2BxEF1#6外，所有品系雄性的寿命都与J-06相当。

本研究采用的主要技术方法包括：利用piggyBac转座子系统进行种系转化建立转基因品系；通过RT-PCR和测序分析发育阶段特异性基因表达和性别特异性剪接；采用两种多西环素喂养方案评估雌性致死效果；通过交配成功率、竞争性交配指数和寿命测定综合评价雄性适应度。实验使用的螺旋蝇样本来自巴拿马COPEG大规模饲养工厂的Jamaica-06品系。

发育表达和tTA转录本的可变剪接

通过RT-PCR分析发现，DR9品系中Chhalo启动子主要在胚胎期活跃，而DR10品系中g6451启动子在所有发育阶段均有表达。转录本测序证实tTAv转录本发生了性别特异性剪接，只有雌性能够产生编码功能性tTA蛋白的mRNA。在DR10品系中还发现了g6451基因5'UTR中一个未被注释的内含子。

双组分DR9和DR10品系的胚胎和雌性致死

在标准多西环素喂养方案下，双纯合品系的生产性能与J-06相当。去除多西环素后，DR9品系在改良喂养方案下实现了早期雌性致死，而DR10品系的雌性致死主要发生在蛹期。DR10#5AxEF1#6品系在改良方案下无法产生成虫，可能是由于tTA过度表达导致。

交配表现和寿命

DR10#4-3xEF1#6品系雄蝇在交配成功率和竞争力方面表现最佳，与J-06雄蝇相当。大多数品系雄蝇的寿命与对照无显著差异，只有DR9#3-2BxEF1#6品系雄蝇寿命显著缩短。

研究结论表明，没有单一品系完美满足所有预期标准。DR9品系更接近早期雌性致死的目标，但在雄性竞争力或生产性能方面存在不足。DR10#4-3xEF1#6品系虽然实现的是晚期雌性致死，但其优良的雄性适应度使其成为最有前景的候选品系。值得注意的是，晚期致死系统在某些情况下可能比早期致死系统更有效，特别是在幼虫期存在密度依赖效应时。此外，转基因性别筛选品系相比野生型品系具有更高的生物安全性，即使有可育蝇逃逸，其雌性后代也无法在无四环素环境中存活建立种群。

这项研究为改进新大陆螺旋蝇的遗传防治策略提供了重要进展，展示了通过优化性别特异性表达系统提高防治效率的潜力。DR10#4-3xEF1#6品系的良好表现也为开发其他害虫的遗传防治方案提供了有益参考。研究人员计划寻求监管批准，对一种或多种螺旋蝇转基因性别筛选品系进行辐射不育雄蝇的田间试验。