Gli1+基质细胞：胎儿小鼠肢体中长寿命软骨祖细胞的高修复性前体细胞

《Nature Communications》：Gli1-expressing stromal cells are highly reparative precursors of long-lived chondroprogenitors in the fetal murine limb

本研究针对长骨生长板中长寿命软骨祖细胞（LLCPs）的起源与调控机制这一关键科学问题，通过构建软骨特异性细胞周期阻滞模型，结合单细胞转录组测序和谱系追踪技术，发现Gli1+基质细胞是产后LLCPs的胎儿期前体，并在软骨损伤后可被激活以补偿生长缺陷。进一步揭示Pdgfra+基质细胞是Gli1+ LLCPs的重要来源，且CCN2信号通路负向调控其活化。该研究为骨骼生长障碍的治疗和软骨再生提供了新的靶点。

　　

长骨的生长依赖于生长板软骨的持续增殖与分化平衡，其中长寿命软骨祖细胞（LLCPs）是维持骨骼纵向生长的关键驱动力量。然而，LLCPs在胎儿期的起源及其在发育扰动下的适应性调控机制尚不明确。这不仅阻碍了我们对人类身高变异、肢体比例进化及骨骼生长障碍病因的理解，也限制了相关治疗策略的开发。传统观点认为，胎儿期的软骨祖细胞仅具有短期增殖能力，无法形成长期存活的克隆柱，而LLCPs可能在出生后才出现。但这一过程是源于胎儿期已存在的静止前体细胞，还是由外部细胞招募而来，仍存在争议。此外，骨骼系统在面临细胞功能或活性受损的挑战时，能否通过激活潜在修复机制实现“发育稳健性”，亦是未解之谜。

针对上述问题，研究团队通过构建小鼠模型，结合前沿的分子生物学技术展开研究。主要技术方法包括：利用可诱导的转基因小鼠模型（如Pitx2-Cre/Col2a1-rtTA介导的左侧特异性或全身性软骨靶向p21过表达模型）诱导细胞周期阻滞；采用单细胞核RNA测序（snRNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析细胞群体变化；通过Gli1CreER、PdgfraCreER等谱系追踪工具结合多色报告系统（RGBow）明确细胞起源与命运；利用体外器官培养和信号通路干预（如CCN2处理）验证分子机制；并借助免疫组化、杂交链式反应（HCR）等技术进行空间定位和定量分析。

细胞周期阻滞触发Gli1⁺细胞的补偿性反应

研究团队首先利用左侧软骨特异性p21过表达模型（Left-Cart-p21MOE）诱导胎儿期软骨细胞周期阻滞，发现尽管初期出现生长缺陷，但至出生后100天（P100）时，实验侧与对照侧的股骨和胫骨长度无显著差异，表明存在补偿机制。通过snRNA-seq分析E16.5膝关节细胞，发现实验侧软骨中GLI1转录活性显著上调，提示Gli1⁺细胞可能参与修复。进一步利用全身性软骨p21过表达模型（Pan-Cart-p21MOE）结合Gli1谱系追踪（Gli1CreER; R26^LSL-tdTom）发现，在p21诱导后，Gli1⁺细胞在软骨中的贡献显著增加，且增殖区细胞中Gli1谱系比例上升。

为区分补偿源于原有Gli1⁺细胞扩增还是新生Gli1⁺细胞招募，研究团队通过调整他莫昔芬（TM）和多西环素（Dox）给药顺序发现，在Dox先给方案（先诱导p21表达）中，Gli1谱系扩张更显著，且部分初始Gli1^-细胞在损伤后获得Gli1表达，表明软骨微环境可激活基质细胞的Gli1表达潜能。功能实验显示，特异性清除Gli1谱系软骨细胞（Gli-Cart-DTA模型）会破坏Pan-Cart-p21MOE的补偿能力，导致骨骼缩短，证实Gli1⁺细胞是修复所必需的。

胎儿期Gli1⁺细胞贡献产后生长板多数软骨细胞

为明确Gli1⁺细胞在正常生长中的作用，研究团队在E12.5或E13.5诱导Gli1谱系标记，发现其贡献随年龄增长而增加，至P60时标记了65-70%的生长板软骨细胞。通过三色报告系统（RGBow）分析克隆动态，发现胎儿期Gli1⁺细胞产生两类克隆：短期克隆（出生后迅速消失）和长期克隆（出生后第2周激活，形成贯穿生长板的长柱状结构）。脉冲追踪实验（EdU/CldU）进一步证实，P7后静止区（RZ）中Gli1谱系细胞成为标记滞留细胞的主体，说明其具备LLCP特性。

胎儿期Gli1谱系软骨细胞的必要性在清除实验（Gli-Cart-DTA）中得到验证：尽管清除不完全，但仍导致P100时股骨和胫骨长度显著缩短，表明妊娠末期形成的Gli1⁺软骨细胞对长期骨骼生长至关重要。

LLCPs源于持续整合入软骨的Gli1⁺细胞

通过构建可诱导的核绿色荧光蛋白（nGL）报告系统（Tigre^TRE-nGL），研究团队发现，E12.5或E17.5的短期Dox脉冲均可在P14静止区检测到nGL⁺标记滞留细胞，且其中多数属于Gli1谱系。延长Dox脉冲（E12.5-E18.5）可显著增加双阳性细胞比例，说明胎儿中后期不断有新的Gli1⁺细胞从周围组织整合入软骨，成为LLCPs。

损伤诱导的Gli1⁺ LLCPs主要源于基质Pdgfra⁺细胞

Pdgfra谱系追踪显示，正常生长中，E13.5标记的Pdgfra⁺细胞对软骨的贡献随发育逐渐增加（P0时达60%），而在Pan-Cart-p21MOE模型中，其贡献进一步扩增。细胞表型分析发现，损伤后软骨中Pdgfra谱系细胞更多表达Gli1，且PDGFRA蛋白阳性细胞在Gli1谱系中显著增加。清除Pdgfra谱系软骨细胞可逆转损伤诱导的Gli1⁺细胞扩增，表明Pdgfra⁺基质细胞是修复性Gli1⁺ LLCPs的主要来源。正常生长中，Pdgfra谱系极少形成长期克隆，提示其贡献需损伤激活。

CCN2抑制Gli1表达与软骨细胞增殖

scRNA-seq分析显示，Pan-Cart-p21MOE软骨中Ccn2表达显著下调。细胞互作分析（MultiNicheNet）进一步证实CCN2信号通路的抑制。HCR实验表明，Ccn2下调发生于Gli1⁺和Gli1^-软骨细胞中，且与p21⁺细胞邻近。功能上，外源CCN2处理可抑制胎儿骨髁中Gli1表达和细胞增殖，而既往研究中软骨过度表达CCN2会导致生长板结构紊乱。这些结果提示，软骨细胞周期阻滞通过降低CCN2水平，解除其对Gli1⁺前体细胞的抑制作用，从而促进修复。

本研究系统揭示了胎儿期Gli1⁺基质细胞作为LLCPs前体的核心角色，并阐明了其在发育挑战下被激活的细胞与分子机制。不仅回答了LLCPs起源这一基础科学问题，更揭示了周围组织作为软骨祖细胞库的“ facultative”潜能，为理解骨骼发育稳健性提供了新范式。此外，鉴定CCN2为Gli1⁺细胞活化的关键负调控因子，为靶向刺激软骨再生提供了理论依据。未来通过调控CCN2等信号分子，或可实现在体诱导基质细胞向功能性LLCPs转化，为生长障碍性疾病和软骨损伤修复开辟新的治疗途径。