靶向肿瘤细胞与免疫抑制巨噬细胞双重铁死亡以增强肝细胞癌免疫治疗的仿生纳米策略

《Nature Communications》：Co-delivery of sorafenib and an FSP1 inhibitor triggers dual ferroptosis in tumor cells and immunosuppressive macrophages for enhanced immunotherapy in mouse models of hepatocellular carcinoma

本研究针对肝细胞癌（HCC）免疫抑制微环境中肿瘤相关巨噬细胞（TAM）削弱索拉非尼（SF）铁死亡诱导疗效的难题，开发了兼具同源靶向与M2型巨噬细胞特异性靶向功能的仿生纳米颗粒Sv@PM-M2p，共载SF与FSP1抑制剂viFSP1（vF），通过同时抑制GPX4和FSP1通路，在肿瘤细胞与M2 TAM中引发协同铁死亡，重塑免疫微环境并增强抗PD-L1疗法抗肿瘤效果，为多病因HCC提供了新型联合治疗策略。

　　

肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，多数患者确诊时已处于晚期，失去了手术机会。由于高度免疫抑制的肿瘤微环境（ITME）以及对传统化疗的耐药性，HCC的治疗效果一直不理想。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是ITME中最丰富的免疫抑制细胞类型之一，其中M2型TAM不仅不能吞噬癌细胞，还会产生免疫抑制因子，如转化生长因子-β（TGF-β）和白介素-10（IL-10），从而削弱免疫刺激细胞的抗肿瘤能力，促进肿瘤生长和生存。因此，靶向M2 TAM以逆转ITME已成为提高HCC治疗响应的重要策略。

铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，以脂质过氧化物（LPO）积累和脂质膜破裂为特征。诱导肿瘤细胞发生铁死亡可以激活局部免疫原性细胞死亡（ICD），释放损伤相关分子模式（DAMP），促进树突状细胞（DC）成熟和巨噬细胞吞噬活性，从而增强CD8⁺ T细胞浸润，激活持久的抗癌免疫应答。然而，癌细胞和M2 TAM可以通过谷胱甘肽（GSH）-谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）轴以及铁死亡抑制蛋白1（FSP1，又称AIFM2）来抵抗铁死亡。FSP1能够将泛醌和维生素K转化为氢醌形式，独立于GPX4抑制脂质过氧化并阻断铁死亡。索拉非尼（sorafenib, SF）是HCC的首个获批全身治疗药物，通过抑制SLC7A11-GPX4轴诱导铁死亡，但治疗后FSP1的上调可能导致耐药性，并与免疫抑制性TAM浸润和不良预后相关。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员开发了一种仿生纳米平台Sv@PM-M2p，用于共同递送SF和FSP1抑制剂viFSP1（vF），以同时靶向HCC细胞和M2 TAM，诱导双重铁死亡，从而增强免疫治疗效果。

研究团队首先通过生物信息学分析发现，在不同病因的HCC中，FSP1是唯一显著上调的铁死亡抑制基因，且与M2 TAM浸润和不良预后相关。在临床样本中，SF治疗后HCC组织的FSP1表达进一步升高。体外实验表明，低剂量的SF与vF联用可协同诱导HCC细胞和M2 TAM的铁死亡。

为了实现在体内的特异性递送，研究人员合成了双硫键连接的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（DS-PLGA）纳米颗粒，用于封装SF和vF（称为Sv@P）。该聚合物具有良好的生物相容性、高载药量和GSH响应性。随后，他们将HCC细胞膜与M2肽（M2pep，一种能够特异性靶向M2型巨噬细胞的12氨基酸肽）结合，形成仿生载体（M-M2p），并包裹Sv@P，形成最终纳米制剂Sv@PM-M2p。该制剂具有“膜-核”结构，粒径约为134 nm，表面电荷约为-18 mV，并表现出良好的稳定性和GSH响应性。体外靶向实验证实，Sv@PM-M2p能够特异性被HCC细胞和M2 TAM摄取，而避免被其他免疫细胞或正常细胞吸收。

在体内实验中，Sv@PM-M2p在荷瘤小鼠模型中显示出延长的血液循环时间和显著的肿瘤积聚。该纳米制剂通过同源靶向和M2pep介导的靶向能力，将药物特异性递送至肿瘤细胞和M2 TAM。在高水平GSH的肿瘤细胞内，纳米颗粒降解并释放SF和vF，有效抑制GPX4和FSP1，诱导铁死亡。结果表明，Sv@PM-M2p处理显著抑制了肿瘤生长，并减少了M2 TAM的比例，同时增加了M1型TAM和细胞毒性T细胞的浸润。此外，铁死亡的肿瘤细胞释放DAMP，如钙网蛋白（CRT）、ATP和高迁移率族蛋白B1（HMGB1），促进DC成熟和T细胞激活，从而将免疫抑制性的“冷”肿瘤转变为免疫刺激性的“热”肿瘤。

研究还发现，Sv@PM-M2p治疗会上调PD-L1表达，可能导致T细胞耗竭。因此，研究人员将Sv@PM-M2p与抗PD-L1单克隆抗体（mAb）联用，在双侧皮下HCC模型中几乎完全消除了原发和转移肿瘤，并激活了系统性免疫记忆。在免疫人源化的患者来源异种移植（PDX）模型中，Sv@PM-M2p在HBV驱动和NASH驱动的HCC中均表现出优于一线临床疗法的抗肿瘤效果，尽管在NASH背景下其免疫招募能力略有减弱。

主要技术方法包括：使用DS-PLGA构建GSH响应性纳米颗粒；利用HCC细胞膜和M2pep进行功能化修饰，实现双重靶向；通过体外共培养模型、3D肿瘤球体实验和流式细胞术评估铁死亡和免疫应答；在免疫人源化PDX模型（样本来自HCC患者手术切除组织）中验证治疗效力。

研究结果

FSP1在HCC中的表达及其与预后的关系

通过整合多个单细胞RNA测序数据集，研究人员发现M2 TAM是HCC肿瘤组织中比例最高的免疫抑制细胞。细胞轨迹分析显示，M2 TAM中铁死亡抑制基因的表达随其成熟而增加。生存分析表明，FSP1高表达与HCC患者总生存期缩短相关，且在SF治疗后进一步上调。

Sv@PM-M2p的制备与表征

Sv@PM-M2p具有典型的“膜-核”结构，粒径约134 nm，PDI约为0.25。体外释放实验表明，该纳米制剂在GSH存在下快速释放药物，但在酸性环境中保持稳定。细胞摄取实验证实其能够特异性靶向HCC细胞和M2 TAM。

体外抗肿瘤效果与铁死亡诱导

Western blot分析显示，Sv@PM-M2p处理显著降低了GPX4和FSP1的表达。Live/Dead染色、克隆形成和流式细胞术实验表明，该制剂有效抑制HCC细胞增殖并诱导细胞死亡。透射电镜观察到线粒体收缩和嵴减少，JC-1染色显示线粒体膜电位下降，C11 BODIPY581/591检测证实LPO积累，这些变化均可被铁死亡抑制剂Liproxstatin-1（Lip-1）逆转。

M2 TAM的铁死亡与ICD效应

在M2 TAM中，Sv@PM-M2p同样诱导了铁死亡，表现为LPO积累和细胞死亡。在3D肿瘤球体模型中，该纳米颗粒穿透球体并引起显著细胞死亡。此外，Sv@PM-M2p处理的HCC细胞释放CRT、ATP和HMGB1，并促进DC成熟和免疫刺激细胞因子（如TNF、IL-6和IL-12）的分泌。

体内抗肿瘤效果与免疫微环境重塑

在皮下和原位HCC模型中，Sv@PM-M2p显著抑制肿瘤生长并延长生存期。流式细胞术分析显示，该制剂减少M2 TAM比例，增加M1 TAM、活化DC和细胞毒性T细胞浸润。与抗PD-L1抗体联用可进一步抑制肿瘤转移和复发，并激活记忆T细胞。

讨论与结论

本研究揭示了FSP1作为HCC治疗新靶点的重要性，其上调与SF耐药和免疫抑制性TAM浸润相关。通过构建仿生纳米平台Sv@PM-M2p，研究人员实现了SF和vF的协同递送，同时在肿瘤细胞和M2 TAM中诱导铁死亡，有效重塑了ITME，并增强了抗PD-L1疗法的疗效。在免疫人源化PDX模型中的成功验证表明，该策略对不同病因的HCC均具有治疗潜力。这些发现为HCC的铁死亡-免疫联合治疗提供了新思路，具有重要的临床转化价值。