人源细胞器SPFH蛋白复合物的高分辨率冷冻电镜结构解析揭示其独特组装机制与功能意义

《Nature Communications》：Structures of human organellar SPFH protein complexes

本研究针对真核生物细胞器中SPFH蛋白复合体（如内质网Erlin1/2复合物和线粒体PHB1/2复合物）的精确结构和功能机制不明确的问题，通过单颗粒冷冻电镜技术解析了其高分辨率三维结构。研究发现Erlin1/2复合物由13个异源二聚体（共26个亚基）组成圆顶状笼形结构，而PHB1/2复合物则以11个异源二聚体（22个亚基）形成存在闭合与开放两种构象的动态组装。该研究首次揭示了细胞器SPFH复合物的特异性 stoichiometry 和分子组织方式，为理解其在膜蛋白质量控制、脂质微域形成及相关神经系统疾病中的作用提供了结构基础。

　　

在细胞这座精密的生命工厂中，膜结构如同分工明确的车间，而驻扎在膜上的蛋白质机器则是完成各类生命活动的关键执行者。其中，SPFH蛋白家族（以其代表成员Stomatin、Prohibitin、Flotillin和HflK/C命名）作为一个在生命三界中广泛存在且结构古老的蛋白家族，通过形成独特的环状寡聚化复合物，在细胞膜组织、蛋白质质量控制等基础生命过程中扮演着重要角色。尤其引人注目的是，这些蛋白复合物大多锚定在膜上，形成圆顶状的分子笼结构，但其精确的组成结构和工作机制长期以来如同一个“黑箱”，困扰着科学家们。

尽管先前的研究已解析了细菌中的HflK/C复合物、胞质中的vault复合物和flotillin复合物的结构，但所有位于真核生物膜结合细胞器（如内质网和线粒体）内部的SPFH复合物的结构仍然未知。这其中，内质网腔内的Erlin1/2复合物和线粒体膜间隙的PHB1/2（Prohibitin）复合物尤为关键。它们被认为是原核生物HflK/C复合物在真核细胞中的功能类似物，可能通过与AAA蛋白酶等因子协作，参与新生成膜蛋白的质量控制。Erlin1/2的功能失常与遗传性痉挛性截瘫（HSP）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关，而PHB1/2的失调则涉及癌症、肥胖、糖尿病及神经退行性疾病。然而，由于缺乏高分辨率的精细结构，这些复合物如何组装、如何工作，以及其异常如何导致疾病，始终是领域内悬而未决的核心问题。

为了解决这一难题，由Jingjing Gao、Dawafuti Sherpa等共同完成，Sichen Shao作为通讯作者的研究团队，在《Nature Communications》上发表了他们的最新成果。他们利用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）技术，成功解析了人源Erlin1/2和PHB1/2复合物的近原子分辨率结构，首次清晰地揭示了这两种重要细胞器SPFH复合物的独特化学计量比、分子构筑原理和动态构象变化，为深入理解其功能机制提供了坚实的结构蓝图。

本研究主要依赖于单颗粒冷冻电镜技术。研究人员通过在Expi293F细胞中共同表达带有不同标签的Erlin1/Erlin2或PHB1/PHB2，利用串联亲和纯化策略从去垢剂 solubilized 的膜组分中分离得到完整的蛋白复合物。纯化后的复合物经过尺寸排阻色谱进一步分离纯化，用于制备冷冻电镜样品。数据收集在300 kV的Titan Krios电镜上进行，使用K3或Falcon 4i直接电子探测器。获得的显微图像经过运动校正、对比度传递函数（CTF）估计等预处理后，进行颗粒挑选、二维分类、三维分类及多次三维重构优化，最终获得高分辨率结构。利用ModelAngelo、Coot和Phenix等软件进行原子模型搭建和优化。此外，研究还通过蓝绿原生胶电泳（BN-PAGE）和点突变细胞回补实验，验证了关键相互作用对复合物组装的贡献。

Cryo-EM structure of the ER-resident Erlin1/2 complex

研究人员首先解析了内质网驻留的Erlin1/2复合物结构。该复合物形成一个高达165 ?、伸入内质网腔的圆顶状笼形结构。其宽端（由SPFH结构域形成）直径约210 ?，窄端（由C端区域形成）直径约115 ?。通过细致的图像处理和三维重构，研究团队确定该复合物由26个亚基组成，并提出了由13个Erlin1/Erlin2异源二聚体交替排列而成的模型。这是首次在原子水平上揭示该复合物的精确化学计量比和整体架构。

Key interactions within the Erlin1/2 complex

研究进一步揭示了维持Erlin1/2复合物结构稳定性的关键分子相互作用。除了N端跨膜区，SPFH1结构域中的疏水和芳香族残基可能参与复合物与内质网膜腔面的结合。相邻SPFH2结构域之间的界面由两个氢键稳定。紧随其后的CC1螺旋通过氢键和其他静电相互作用交织，形成由26个螺旋组成的密封壁。尤为重要的是，复合物窄端形成一个四层结构，包括CC2螺旋层、平行β9链层以及交替延伸的C端区域（CT）。CT中的一个保守疏水基序（IPNMF）参与广泛的疏水堆积相互作用，对高阶组装至关重要。

Positions and impacts of Erlin mutations

研究人员将已知的与遗传性痉挛性截瘫（SPG18, SPG62）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关的Erlin1和Erlin2突变位点映射到结构上，发现这些突变主要集中在三个关键区域：ER膜界面、SPFH2结构域内部或亚基界面、以及CC2和CT结构域。这些突变很可能通过干扰复合物的正确组装或稳定性，从而导致疾病发生。通过点突变和蓝绿原生胶电泳分析，研究证实破坏CC2螺旋相互作用或CT区IPNMF基序的突变会严重损害复合物组装，而破坏SPFH2结构域氢键或交换 paralog 特异性残基的突变影响相对较小，这为理解疾病致病机制提供了分子层面的解释。

Cryo-EM structures of the mitochondrial PHB1/2 complex

研究团队接着解析了线粒体膜间隙中的PHB1/2复合物结构。该复合物同样形成圆顶状笼形结构，高约110 ?，窄端直径约85 ?。与Erlin1/2复合物不同，PHB1/2复合物由11个PHB1/PHB2异源二聚体（共22个亚基）组装而成。尽管在纯化物中能检测到线粒体AAA蛋白酶（如AFG3L2、SPG7）的存在，但在最终的冷冻电镜结构中并未发现其稳定的共纯化或相应的密度，提示其相互作用可能是瞬态的或异质性的。

Conformational heterogeneity of the PHB1/2 complex

一个重要的发现是PHB1/2复合物存在构象异质性。研究人员解析了其“闭合”构象（整体分辨率2.4 ?）和“开放”构象（整体分辨率3.1 ?）。开放构象中，SPFH结构域之间的间隙增大，其宽端直径从闭合状态的约190 ?增加至约196 ?。构象变化主要发生在SPFH结构域和相邻的CC1区域，而复合物的C端部分基本保持不变。这种动态性可能为底物蛋白的进出提供了另一种途径。

Key interactions within PHB1/2 complexes

与Erlin1/2复合物类似，PHB1/2复合物的膜锚定依赖于N端跨膜螺旋和SPFH1结构域的疏水/芳香族残基。在闭合构象中，相邻SPFH结构域之间通过氢键和疏水堆积相互作用紧密连接，同时存在广泛的氢键网络连接SPFH2结构域与CC1螺旋。这些相互作用在开放构象中大部分丢失。复合物窄端同样形成四层结构，并通过氢键网络和疏水堆积相互作用稳定。特别值得注意的是，PHB2的CT在β9后转向朝笼的外缘延伸，而PHB1的CT则伸向中心形成一个直径约18 ?的中央通道。破坏CC2螺旋相互作用的突变对复合物组装的影响最为严重，特别是影响了PHB1的掺入。

Comparisons of SPFH complex organizations

通过将Erlin1/2和PHB1/2复合物的结构与已知的其他SPFH复合物（如HflK/C、flotillin、vault）进行比较，研究揭示了SPFH复合物在遵循相似组装原则（形成圆顶状结构）的同时，在亚基数量、整体尺寸上表现出显著的多样性。研究还发现，SPFH复合物中的亚基总数与CC1螺旋的长度存在良好的相关性，这可能有助于预测其他未知SPFH复合物的化学计量比。另一个共同的组织原则是，在异源二聚SPFH复合物中，两个paralog的C端区域（CT）通常呈现交替的不同构象，一个朝向笼中心，另一个则转向外缘。此外，这些复合物笼状结构的中心“帽区”似乎并非完全封闭，可能存在通道或由未结构化的C端序列填充，这可能与其功能相关。

综上所述，这项研究通过高分辨率冷冻电镜结构解析，首次阐明了人源细胞器SPFH蛋白复合物（Erlin1/2和PHB1/2）独特的化学计量比、分子构筑细节和动态构象变化。这些结构不仅为理解SPFH复合物的组装机制提供了蓝图，更重要的是，为深入探究其在膜蛋白质量控制、脂质微域组织以及相关人类疾病（如遗传性痉挛性截瘫、肌萎缩侧索硬化症、癌症等）中的作用机制奠定了坚实的分子基础。研究所揭示的SPFH复合物结构的多样性与共同原则，将推动未来对这类重要分子机器功能机制的进一步探索，并可能为相关疾病的干预策略提供新的线索。