RIOK2激酶通过调控FADD-RIPK1-Caspase-8复合物内质网转运及Gasdermin D剪切驱动细胞焦亡的机制研究

《Nature Communications》：RIOK2 kinase regulates the translocation of the FADD–RIPK1–Caspase-8 complex to the ER and the cleavage of Gasdermin D to drive pyroptosis

本研究揭示了RIOK2激酶在caspase-8依赖性Gasdermin D（GSDMD）剪切和细胞焦亡中的关键调控作用。研究人员发现RIOK2通过其激酶活性驱动肌球蛋白II激活，促进溶酶体-内质网（ER）转运，进而将FADD-RIPK1-caspase-8复合物从溶酶体转移至ER；同时其ATPase活性直接触发caspase-8和GSDMD的剪切。该研究阐明了细胞器互话在Gasdermin蛋白空间剪切中的新机制，为宿主防御耶尔森菌感染提供了新的治疗靶点。

　　

当致病菌耶尔森菌入侵机体时，巨噬细胞会通过一种特殊的细胞死亡方式——细胞焦亡（pyroptosis）来对抗感染。这种细胞死亡方式依赖于caspase-8介导的Gasdermin D（GSDMD）蛋白剪切，然而调控这一过程的上游机制一直不明确。近日发表在《Nature Communications》的研究首次发现，一种名为RIOK2的激酶在这一过程中发挥着关键作用。

在细菌感染或脂多糖（LPS）和转化生长因子β激活激酶1（TAK1）抑制剂刺激下，巨噬细胞会启动caspase-8依赖的GSDMD剪切和细胞焦亡。然而，这一通路的具体调控机制仍是领域内的未解之谜。研究人员通过免疫共沉淀和质谱分析发现，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶RIOK2与死亡结构域相关蛋白（FADD）存在相互作用，且这一相互作用对于caspase-8驱动的GSDMD剪切至关重要。

研究团队发现RIOK2的激酶活性通过激活肌球蛋白II，驱动溶酶体向ER的转运，从而将FADD-RIPK1-caspase-8复合物从溶酶体转移至ER。更重要的是，RIOK2的ATPase活性增强了其与该复合物的结合，并直接在ER和体外实验中触发caspase-8和GSDMD的剪切。进一步的动物实验表明，RIOK2介导的细胞焦亡增强了宿主对耶尔森菌感染的防御能力。

关键技术方法包括：利用CRISPR-Cas9技术构建Riok2基因敲除小鼠模型；通过免疫共沉淀和质谱分析鉴定蛋白质相互作用；采用细胞器分离技术研究蛋白质亚细胞定位；使用体外激酶实验和蛋白剪切实验验证分子机制；通过体内感染实验评估宿主防御功能。实验使用了永生化骨髓来源巨噬细胞（iBMDMs）、HEK293T细胞和HeLa细胞系，以及从Riok2条件性敲除小鼠分离的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）。

RIOK2促进复合体II的形成

研究人员通过免疫共沉淀和质谱分析发现，在TNF-α和TAK1抑制剂5z-7刺激下，RIOK2与FADD存在特异性相互作用。这一相互作用在耶尔森菌感染或LPS/5z-7刺激的巨噬细胞中得到验证。RIOK2不仅与FADD结合，还能与RIPK1和caspase-8形成复合物。基因敲除实验表明，RIOK2对于FADD-RIPK1-caspase-8复合物的稳定性至关重要。

RIOK2缺失影响细胞焦亡

在Riok2敲除的巨噬细胞中，LPS/5z-7诱导的细胞死亡显著减弱，表现为ATP损失减少、乳酸脱氢酶（LDH）释放下降以及IL-1β和IL-18分泌减少。Western blot分析显示，caspase-8成熟和GSDMD剪切在RIOK2缺陷细胞中受到明显抑制。重要的是，体外实验证实RIOK2能直接激活caspase-8和GSDMD的剪切。

RIOK2定位於内质网

共聚焦显微镜和细胞组分分离实验显示，RIOK2主要定位于ER，而非溶酶体、线粒体或高尔基体。研究人员发现Polo样激酶1（PLK1）介导的RIOK2磷酸化对其ER定位至关重要。抑制PLK1活性或突变RIOK2磷酸化位点（S335A/S380A/S548A）会阻断RIOK2向ER的转运。

ER定位的RIOK2促进细胞焦亡

实验表明，ER定位的RIOK2与FADD在ER共定位，并促进FADD-RIPK1-caspase-8复合物在ER的形成。表达不能定位至ER的RIOK2突变体（S3A）的细胞，其RIPK1磷酸化以及caspase-8和GSDMD的剪切均受到抑制，说明RIOK2的ER定位对细胞焦亡至关重要。

RIOK2驱动溶酶体向ER的转运

研究发现LPS/5z-7刺激可诱导溶酶体与ER的共定位，这一过程依赖于RIOK2。细胞组分分离实验显示，FADD-RIPK1-caspase-8复合物先在溶酶体出现，随后转运至ER。RIOK2缺失不影响该复合物在溶酶体的形成，但几乎完全阻断其向ER的转运和GSDMD在ER的剪切。

RIOK2激酶或ATPase活性驱动细胞焦亡

使用RIOK2 ATPase抑制剂CQ211或表达激酶活性缺失突变体（D246A）的实验表明，RIOK2的激酶和ATPase活性对其功能至关重要。这些活性不仅调控肌球蛋白II的磷酸化和溶酶体-ER转运，还直接参与FADD-RIPK1-caspase-8复合物的形成和GSDMD的剪切。

RIOK2介导的细胞焦亡有助于炎症和宿主防御

在耶尔森菌感染模型中，RIOK2缺陷小鼠表现出更严重的感染表型，脾脏和肝脏中细菌载量显著升高。使用RIOK2抑制剂CQ211处理的小鼠也出现类似表型，证实RIOK2在宿主防御中的关键作用。

该研究揭示了细胞焦亡调控的新机制：RIOK2通过其激酶活性激活肌球蛋白II，驱动溶酶体向ER的转运，促进FADD-RIPK1-caspase-8复合物从溶酶体向ER的转移；同时通过其ATPase活性直接触发caspase-8和GSDMD在ER的剪切。这一发现不仅阐明了细胞器互话在细胞死亡过程中的重要作用，也为治疗细菌感染和炎症性疾病提供了新的潜在靶点。研究提出的空间能量依赖性GSDMD剪切机制，为理解细胞死亡程序的精细调控提供了新视角。