脱钙溶液对小鼠骨骼细胞形态及免疫染色影响的评估

《Journal of Histotechnology》：Assessment of decalcification solutions on cellular morphology and immunostaining of mouse bones

小鼠骨骼样本经三种市售解钙剂（Immunocal、Epredia、Rapid-Cal）处理后，评估解钙速度、组织结构保留及免疫组织化学抗原性。结果显示，三种解钙剂均能有效解钙（X光、铵盐试纸、弯曲/切割测试），其中Immunocal综合表现最优，解钙时间适中且保持最佳组织结构和抗原性。研究为病理诊断实验室选择解钙剂提供依据。

　　在生物医学研究和病理诊断中，组织样本的处理是一个关键环节。其中，脱钙是一个不可或缺的步骤，尤其是在处理含钙的组织，如骨骼时。脱钙的目的是去除组织中的矿物质成分，使得原本坚硬的骨骼能够被切割成薄片，便于后续的组织学分析和免疫组化检测。然而，脱钙过程也带来了挑战，因为某些脱钙试剂虽然能快速软化组织，但可能对蛋白质结构和形态造成影响，而另一些试剂虽然能较好地保持蛋白质的完整性，但脱钙效率较低。因此，寻找一种既能快速完成脱钙，又能保持组织结构和免疫活性的试剂，是实验室工作中的重要目标。

本研究的目的是评估三种市面上常见的脱钙试剂对小鼠骨骼样本的脱钙效果，以确定哪一种最适合用于后续的组织学分析和免疫组化检测。所选的三种试剂分别是Immunocal?（StatLab）、Epredia?（Epredia）和Rapid-Cal?（StatLab），它们都被宣传为适用于免疫组化检测的快速且安全的脱钙试剂。实验对象是小鼠的三种骨骼：股骨、颅骨和胸骨。这些骨骼在生物医学研究中较为常见，且在组织学分析中具有重要的应用价值。

实验中，首先将这些骨骼样本固定在10%中性缓冲福尔马林中，固定时间为73小时。随后，将它们分别置于上述三种脱钙试剂中进行脱钙处理，处理时间包括4小时、6小时、12小时、24小时、30小时、48小时和73小时。在每个时间点，样本都会接受一系列评估，包括X光检查、弯曲和切割测试，以及铵草酸盐浊度测试。这些测试用于判断脱钙的程度和效果。X光检查能够显示骨骼的矿化状态，而弯曲和切割测试则能直观地反映组织的软化程度。铵草酸盐浊度测试是一种化学方法，通过观察溶液的澄清度来判断是否完全去除了钙质。

在完成脱钙处理后，样本被常规处理、包埋在石蜡中，并切成5微米厚的切片，用于苏木精-伊红（H&E）染色和三种免疫组化染色（CD3、CD31和Iba1）。这些染色方法分别用于检测T淋巴细胞、内皮细胞和单核细胞相关的抗原。通过这些方法，研究人员能够评估脱钙试剂对组织结构和抗原保持能力的影响。此外，所有样本均由两名经验丰富的专家进行评分，以确保评估的客观性和一致性。

实验结果显示，三种脱钙试剂均能有效完成脱钙，同时保持组织的完整性和细胞细节。然而，Immunocal在所有三个组织类型中表现出更优的脱钙趋势。尽管这些评分差异并未达到统计学意义上的显著性，但整体趋势表明Immunocal在脱钙效果、组织结构保持和免疫活性方面具有更佳的表现。这使得Immunocal成为实验室中最优选的脱钙试剂。

X光图像显示，Immunocal处理的样本在24小时后已基本失去矿化特征，呈现出良好的脱钙效果。而Epredia处理的样本则在30小时后才显示出类似的脱钙趋势。相比之下，Rapid-Cal处理的样本在6小时后就已显示出较高的脱钙程度，甚至在12小时后颅骨也变得完全透明。然而，这种快速脱钙可能对组织结构造成一定影响，例如在高倍镜下观察时，Rapid-Cal处理的样本显示出细胞细节的损失，包括细胞核的模糊和细胞边界的变化。这表明虽然Rapid-Cal能够快速完成脱钙，但在保持组织结构方面可能不如Immunocal。

弯曲和切割测试进一步验证了这些观察结果。在Immunocal处理的样本中，股骨在4小时后已经变得柔软，可以在24小时后轻松切割。颅骨则在30小时后才表现出足够的柔软度，而胸骨在较短的时间内即达到了最佳的脱钙状态。相比之下，Rapid-Cal处理的样本在6小时后即显示出良好的脱钙效果，但随着处理时间的延长，其对组织结构的破坏性逐渐显现。特别是在73小时的处理后，Rapid-Cal处理的样本显示出较为明显的细胞细节损失。

此外，铵草酸盐浊度测试的结果也支持这些观察。在Immunocal处理的样本中，随着时间的推移，溶液的浊度逐渐降低，表明钙质正在被有效去除。Epredia处理的样本则显示出更渐进的浊度变化，而Rapid-Cal处理的样本在较短时间内即呈现出完全澄清的状态。这说明Rapid-Cal的脱钙效率较高，但可能对组织的完整性造成一定影响。

在免疫组化检测方面，三种脱钙试剂处理的样本均显示出良好的抗原保持能力。H&E染色结果显示，所有样本在脱钙后都能保持较好的组织结构，没有明显的组织破坏或变形。在CD3、CD31和Iba1的免疫组化染色中，所有样本均能显示出清晰的抗原信号，且与未脱钙的对照样本相比，没有出现明显的信号减弱或丢失。这表明这三种脱钙试剂在保持组织免疫活性方面均表现出色。

尽管实验结果并未显示统计学意义上的显著差异，但整体趋势表明Immunocal在脱钙效果、组织结构保持和免疫活性方面具有更优的表现。因此，Immunocal被推荐为实验室中首选的脱钙试剂。然而，研究人员也指出，Rapid-Cal的快速脱钙特性可能在某些情况下具有优势，尤其是在需要快速处理的实验中。不过，为了确保组织的完整性和免疫活性，仍需在脱钙过程中进行适当的监控和调整。

此外，实验中还考虑了样本的标准化问题。所有样本均来自相同性别、品系、年龄和体重的小鼠，以减少生物变量对实验结果的影响。同时，样本的采集和处理方法也被严格标准化，以确保实验的可重复性和结果的可靠性。这种标准化方法在实验室研究中尤为重要，因为它有助于提高实验的准确性和一致性。

总的来说，本研究为实验室提供了重要的参考信息，表明三种市面上常见的脱钙试剂均适用于小鼠骨骼样本的脱钙处理。Immunocal在脱钙效果、组织结构保持和免疫活性方面表现出更佳的趋势，因此被推荐为实验室中的首选试剂。然而，研究人员也指出，未来的实验可以进一步评估这些脱钙试剂对其他免疫组化标记物的影响，以及它们在其他诊断测试中的表现，如原位杂交（ISH）、免疫荧光（IF）和聚合酶链反应（PCR）。这些研究可以为更广泛的实验室应用提供支持。

本研究的另一个重要发现是，脱钙过程对组织的免疫活性没有负面影响。这意味着脱钙后的组织仍然适合用于免疫组化检测，从而为实验室提供了一种更高效的处理流程。此外，实验还强调了标准化在脱钙研究中的重要性，因为标准化能够减少生物变量的影响，提高实验的准确性和可靠性。

最后，研究指出，虽然实验结果并未显示统计学意义上的显著差异，但整体趋势表明Immunocal在脱钙效果、组织结构保持和免疫活性方面具有更优的表现。因此，Immunocal被推荐为实验室中首选的脱钙试剂。然而，研究人员也指出，Rapid-Cal的快速脱钙特性可能在某些情况下具有优势，尤其是在需要快速处理的实验中。不过，为了确保组织的完整性和免疫活性，仍需在脱钙过程中进行适当的监控和调整。

本研究的结果对于高通量诊断组织学实验室具有重要的实际意义。它不仅提供了关于脱钙试剂性能的详细信息，还为实验室选择合适的脱钙试剂提供了科学依据。此外，研究还强调了标准化在脱钙研究中的重要性，因为标准化能够减少生物变量的影响，提高实验的准确性和可靠性。这些发现对于提高实验室工作效率和保证实验结果的可靠性具有重要的参考价值。