针对多结构域生物制剂的临床抗药抗体的异质性和演变表位特征：以TAK-186为例

《mAbs》：Heterogeneous and evolving epitope landscape of clinical anti-drug antibodies against multidomain biotherapeutic: a case study of TAK-186

抗药性抗体（ADAs）的表位特异性分析揭示多域生物疗法TAK-186在治疗过程中呈现动态变化的ADAs域特异性分布，尤其是HSA结合域的免疫原性热点。实验结合肽筛选与计算预测方法，阐明域特异性ADAs与药物清除率及临床安全性的潜在关联。

　　在生物制药领域，治疗性蛋白（Therapeutic Proteins, TPs）因其高效性和特异性而受到广泛青睐。然而，这类药物在临床开发过程中常常面临一个重要的挑战——抗药物抗体（Anti-Drug Antibodies, ADAs）的产生。ADAs可能引发一系列复杂的免疫反应，不仅降低药物的疗效，还可能改变药物的暴露量、药代动力学和药效学特性，甚至诱发免疫相关不良事件。因此，对ADAs的免疫原性风险进行深入分析，对于优化治疗性蛋白的设计和临床应用具有重要意义。

在众多治疗性蛋白中，多结构域生物治疗药物（Multidomain Biotherapeutics, MDBs）因其复杂的结构和多样的功能而备受关注。MDBs通常由两个或多个功能结构域组成，能够实现更精确的靶向治疗效果。然而，这种复杂性也带来了额外的免疫原性风险，包括新增的结构域表位、抗原扩散效应以及免疫复合物的形成。由于每个结构域在药物作用机制中承担不同的功能，不同结构域特异性的ADAs可能会对药物的疗效和安全性产生不同的影响。此外，MDBs中多个靶点结合区域的存在，也增加了其与ADAs形成大分子免疫复合物的可能性，这可能导致药物暴露量的减少和毒性风险的上升。

因此，为了更全面地评估MDBs的免疫原性风险，需要采用更为精细的分析方法，特别是针对ADAs表位的解析。传统的多层级ADA检测和中和抗体检测虽然能够提供关于药物免疫原性的初步信息，但它们无法揭示更深层次的表位特异性信息。在本研究中，我们采用了一种综合性的策略，通过结构域特异性分析、线性肽扫描和生物信息学B细胞表位预测，对TAK-186这一多结构域T细胞激活剂（T Cell Engager, TCE）的临床ADA表位景观进行了深入分析。TAK-186是一种95 kDa的多结构域生物治疗药物，属于条件性双特异性导向激活（Conditional Bispecific Redirected Activation, COBRA）TCE类别。它由两个主要结构域组成：活性结构域和关联结构域。活性结构域包含两个针对表皮生长因子受体（EGFR）的VHH结构域（a1和a2）以及一个针对CD3ε的活性scFv结构域（b和c）。关联结构域则包括一个失活的anti-CD3 scFv结构域（d和e）以及一个针对人血清白蛋白（HSA）的VHH结构域（f），后者用于延长药物的半衰期。

TAK-186的激活依赖于肿瘤微环境中特定的蛋白酶（如MMP2/9）对分子结构的切割。在未被切割的情况下，TAK-186的结构域之间通过短的连接肽相互作用，阻止其与CD3的结合，从而避免非特异性T细胞激活。一旦被切割，结构域之间的连接被破坏，活性结构域能够形成具有CD3结合能力的二聚体，从而特异性地靶向EGFR表达的肿瘤细胞。然而，由于TAK-186的三维结构具有高度的动态性和灵活性，目前尚无法完全确定其完整的构象。因此，本研究假设其结构域之间的相互作用模式，以进一步解析其免疫原性特征。

在临床研究中，TAK-186被用于一项开放标签的I/II期试验（NCT04844073），结果显示部分患者在接受多次药物治疗后出现了治疗诱导的抗TAK-186抗体。然而，这些抗体的表位特异性尚未完全阐明。因此，本研究引入了一种综合性的表位分析方法，通过结构域竞争实验和肽扫描实验，结合生物信息学的B细胞表位预测，对TAK-186的ADA表位进行了系统性解析。该方法不仅能够识别ADA对各个结构域的相对贡献，还能揭示ADA表位在药物治疗过程中的动态变化。

研究结果表明，不同患者对TAK-186的ADA表位偏好存在显著差异。例如，在患者3中，早期ADA信号对所有结构域的反应较为均匀，但在治疗后期，针对αHSA VHH的ADA信号显著增强，而针对αEGFR VHH的信号则有所下降。类似的趋势也出现在患者5中，其中αHSA VHH成为ADA的主要靶点。此外，患者1和4中，针对αCD3 scFv的ADA信号呈现逐渐上升的趋势。这些结果提示，尽管TAK-186的结构域之间存在一定的功能重叠，但不同结构域对免疫系统的激活潜力存在显著差异。因此，了解这些差异对于优化药物设计和减少免疫原性风险至关重要。

为了进一步揭示αHSA VHH结构域的表位分布，我们进行了线性肽扫描实验。该实验基于TAK-186的氨基酸序列，合成了一系列15-mer的肽片段，并通过免疫分析检测这些肽片段是否能够被患者样本中的ADA识别。结果显示，几乎所有患者都对某个特定的肽（编号为8）产生了显著的ADA反应，该肽对应于CDR1与框架区2（FR2）的连接区域。此外，肽6（FR1-CDR1连接区域）也被广泛识别。值得注意的是，尽管部分患者对αHSA VHH的ADA信号具有显著变化，但其表位分布的稳定性提示，某些区域可能具有更强的免疫优势性。

除了实验方法，我们还采用了一系列计算工具对TAK-186的B细胞表位进行了预测。BepiPred 3.0和SEMA 1D等序列分析工具能够基于氨基酸序列预测线性表位，而DiscoTope 3.0、SEMA 3D、ElliPro和GraphBepi等结构分析工具则能够结合三维结构信息进行更精确的预测。结果显示，CDR1、CDR2、CDR3以及FR3等区域被多个预测工具识别为潜在的高风险表位。这些结果与实验数据部分吻合，但同时也揭示了不同预测方法之间的差异。因此，为了提高预测的准确性，未来可能需要结合多种方法，并利用更先进的结构预测技术，如ESMFold，以获得更精确的三维结构信息。

本研究还探讨了ADA表位的进化趋势。随着治疗的进行，部分患者的ADA表位偏好从多个结构域逐渐向αHSA VHH集中，这可能反映了免疫系统对特定抗原区域的识别和记忆能力。这种现象在病毒感染中较为常见，但在治疗性蛋白中尚未得到充分研究。因此，我们需要进一步探索免疫系统如何识别和响应不同结构域，以及这些识别过程如何影响药物的疗效和安全性。

此外，研究还强调了个体差异在免疫原性评估中的重要性。患者的HLA类型、免疫状态以及药物的结构和给药方式都可能影响ADA的形成和表位特异性。因此，为了更全面地理解免疫原性风险，未来的研究需要结合更多的患者样本和免疫遗传学数据，以揭示个体间和个体内的差异。

总的来说，本研究通过结构域特异性分析、肽扫描实验和计算预测方法，对TAK-186的ADA表位进行了系统性解析。这些发现不仅有助于理解该药物的免疫原性风险，也为未来多结构域生物治疗药物的设计和开发提供了重要的参考。尽管目前的分析仍存在一定的局限性，例如样本数量不足和部分方法的预测准确性有待提高，但这些结果表明，采用综合性的表位分析策略对于评估和优化生物治疗药物的免疫安全性具有重要的价值。未来的研究应进一步探索更先进的技术手段，如高密度肽阵列和冷冻电镜，以提高表位分析的精度和可靠性。