实时同步监测细菌培养物中的多种分析物

《Applied and Environmental Microbiology》：Real-time simultaneous monitoring of multiple analytes in bacterial cultures

实时监测技术的研究：工程化周质结合蛋白（PBP）作为荧光传感器，成功实现了对葡萄糖、阿拉伯糖、核糖、谷氨酸、精氨酸及鸟氨酸等代谢物的多参数同步检测。该方法在E. coli、P. aeruginosa、S. aureus、E. faecalis和C. striatum等不同菌种中验证了其稳定性和灵敏度，可连续监测24小时且无显著蛋白降解。该技术突破了传统离线检测方法的局限性，为微生物代谢组学研究及工业发酵过程优化提供了非侵入式、模块化解决方案。

　　细菌代谢物在多种生物过程中扮演着关键角色，对人类健康、生态系统以及工业应用具有深远影响。随着对微生物动态研究的深入，实时监测这些代谢物成为理解微生物行为、代谢通量和环境响应的重要手段。然而，当前的监测方法通常依赖于离线分析或单一代谢物的遗传工程改造，这些方法存在操作繁琐、易受污染或无法全面捕捉代谢变化等局限。为解决这些问题，研究团队开发了一种基于工程化膜外结合蛋白（periplasmic binding proteins, PBPs）与荧光标记物结合的新方法，实现了对多种代谢物的同步、实时监测。该方法不仅提高了监测的准确性和灵敏度，还为研究细菌代谢提供了更高效、非侵入性的工具。

PBPs是一类广泛存在于细菌中的受体蛋白，它们能够特异性地识别并结合多种小分子代谢物，包括糖类、氨基酸、离子、金属以及某些芳香族化合物。这些蛋白在细菌的营养摄取、基因表达调控和趋化运动中发挥重要作用。当PBPs与特定代谢物结合时，会发生显著的构象变化，即铰链区域的弯曲运动，从开放状态转变为封闭状态。这种构象变化可以通过在铰链区域或结合口袋附近连接荧光标记物来检测。一旦代谢物浓度发生变化，PBPs的构象变化会引发荧光信号的变化，从而反映代谢物的动态变化。

为了实现对多种代谢物的同步监测，研究团队选择了多种PBPs，如葡萄糖结合蛋白（TnGBP）、阿拉伯糖结合蛋白（ABP）、核糖结合蛋白（TteRBP）和天冬氨酸/谷氨酸结合蛋白（EBP），并分别连接了不同的荧光标记物。这些标记物包括IANBD、Alexa488、Acrylodan和Coumarin等，能够根据PBPs与代谢物结合后的荧光变化进行信号读取。通过实验，研究团队验证了这些PBPs在不同代谢物浓度下的响应特性，并测定了它们的解离常数（Kd）。Kd反映了PBPs对特定代谢物的亲和力，同时也决定了检测的线性范围。例如，TnGBP的Kd为11 μM，意味着其能够可靠地检测葡萄糖浓度在1到110 μM之间的变化。

在实际应用中，研究团队将这些PBPs与荧光标记物结合后，加入到细菌培养液中，并使用荧光平板读数仪进行实时监测。实验显示，这些传感器能够在细菌生长过程中持续检测代谢物的消耗或生成情况，具有较高的时间分辨率。例如，在含有葡萄糖的培养基中，TnGBP-IANBD的荧光信号在细菌对数生长期迅速下降，表明葡萄糖被快速消耗。而在含有阿拉伯糖的培养基中，ABP-Alexa488的荧光变化则更为缓慢，这与阿拉伯糖被利用的延迟现象一致。类似的实验还展示了其他代谢物如核糖、谷氨酸、精氨酸和鸟氨酸在细菌生长过程中的动态变化。这些结果不仅验证了PBPs作为代谢物传感器的有效性，还揭示了细菌在不同碳源条件下的代谢优先级。

此外，研究团队还测试了这些传感器在复杂培养基中的表现。在含有葡萄糖的LB培养基中，TnGBP-IANBD仍然能够检测葡萄糖浓度的变化，表明其在非简单培养条件下的适用性。同样，LAOBP-Acrylodan在LB培养基中也能够有效监测精氨酸和鸟氨酸的动态变化。这种非侵入性的监测方法避免了传统离线分析中可能引入的污染问题，同时也能够提供更精确的代谢物浓度变化数据。

研究还表明，这些PBPs传感器在24小时内保持稳定，能够持续监测代谢物的动态变化。这种稳定性不仅体现在信号的连续性上，还通过凝胶电泳实验验证了蛋白质在长时间实验中的完整性。实验结果表明，即使在复杂的微生物环境中，这些传感器仍然能够保持其特异性，这对于研究细菌间的代谢相互作用具有重要意义。

该方法的优势在于其模块化和可扩展性。通过选择不同的PBPs和荧光标记物，可以构建一个多功能的传感器阵列，用于检测多种代谢物。这种灵活性使得研究者能够根据不同的研究需求，定制化传感器组合，以适应各种实验条件。同时，PBPs的高特异性也确保了监测结果的准确性，避免了交叉反应带来的干扰。

尽管该方法具有诸多优势，但其仍然存在一些局限。例如，目前的监测方法主要基于Kd值的线性范围，通常只能检测两个数量级内的代谢物浓度变化。然而，通过引入不同的PBPs突变体或组合使用多种传感器，可以进一步扩大检测范围，甚至达到五个数量级。这为未来更精确的代谢物浓度分析提供了可能性。

该研究不仅为微生物代谢的实时监测提供了新的工具，也为工业生物过程优化、感染机制研究以及复杂微生物群落的动态分析奠定了基础。在食品和制药工业中，实时监测代谢物的变化有助于优化生产条件，提高产品质量。在感染研究中，这种技术能够揭示细菌在宿主环境中的代谢策略，为抗感染治疗提供新的思路。而在微生物生态学研究中，该方法可以用于分析不同物种之间的代谢相互作用，为理解微生物群落的动态平衡提供数据支持。

总体而言，这项研究展示了一种基于PBPs的新型代谢物监测方法，为微生物学研究提供了重要的技术突破。通过结合工程化PBPs与荧光标记物，该方法实现了对多种代谢物的同步、实时监测，具有高灵敏度和高时间分辨率。同时，该方法的非侵入性和稳定性使其适用于多种细菌种类和复杂的培养环境。未来，随着对PBPs结构和功能的进一步研究，以及更多代谢物的筛选和传感器的开发，这一技术有望在更广泛的领域得到应用，为微生物代谢研究开辟新的方向。