基于孢子对峙的新型高通量筛选平台开发及其在卵菌和真菌病害生防中的应用

《Journal of Applied Microbiology》：Development of a spore-based confrontation assay to screen for biocontrol organisms with antagonistic activity against oomycete and fungal pathogens

本研究针对传统生防菌筛选方法忽略孢子靶点的局限，开发了孢子对峙法(SBCA)用于高通量筛选拮抗致病疫霉和灰葡萄孢的生防菌株。研究表明SBCA较传统菌丝对峙法(MBCA)和显微镜检测具有更高通量和重现性，成功筛选出假单胞菌Pf-5等高效生防菌，为植物病害绿色防控提供了新技术平台。

　　

在农业生产中，由植物病害导致的产量损失高达总产量的40%，而传统化学农药的使用不仅带来环境和健康风险，还导致病原菌抗药性增强。随着全球范围内农药限用政策的实施，生物防治策略在病虫害综合治理(IPM)中的地位日益凸显。然而，微生物生防菌(BCOs)在作物保护领域的市场份额仅占5%，其商业化进程严重受限于筛选方法的效率瓶颈。传统筛选方法主要针对病原菌的菌丝生长阶段，而忽略了在病害传播和侵染过程中起关键作用的孢子阶段，这可能导致具有孢子抑制活性的高效菌株被漏选。

针对这一技术缺口，KU Leuven的研究团队在《Journal of Applied Microbiology》上发表了创新性研究，开发了一种新型孢子对峙法(SBCA)用于高通量筛选对卵菌和真菌病原菌具有拮抗活性的生防菌。该研究以草莓重要病原菌Phytophthora cactorum和Botrytis cinerea为靶标，系统比较了SBCA与传统方法（菌丝对峙法MBCA和显微镜观察）的效能，并通过离体叶片实验验证了筛选结果的可靠性。

研究人员建立了高效的技术体系：采用来自比利时菌种保藏中心的38株细菌（涵盖芽孢杆菌属、假单胞菌属等）作为候选生防菌；通过孢子悬浮液与琼脂培养基混合的方式制备SBCA平板，利用ImageJ软件量化抑菌圈；通过多基因位点序列分型(MLST)进行菌株鉴定；并系统评估了菌株的酶活性（蛋白酶、纤维素酶）、生物表面活性剂产量以及挥发性有机物(VOC)和无细胞提取物(CFE)的抑菌活性。

研究结果显著：

SBCA筛选效能方面，研究发现SBCA对P. cactorum的检出率达76.3%（29/38），对B. cinerea为28.9%（11/38），且所有对B. cinerea有效的菌株均对P. cactorum有效。与MBCA（59.4%检出率）和显微镜观察（75%检出率）相比，SBCA展现出更高的灵敏度和重现性（组间相关系数0.80）。

菌株功能特性方面，研究发现34株菌具有蛋白酶活性，14株具有纤维素酶活性，4株产生生物表面活性剂。值得注意的是，假单胞菌属菌株是挥发性抑菌物质的主要生产者，其中Pseudomonas protegens Pf-5和P. bananamidigenes BW7P1表现出最强的综合抑菌能力。

离体叶片验证实验中，Pseudomonas protegens Pf-5和P. bananamidigenes BW7P1显著降低了病害严重度，使叶片坏死面积从83%降至15%（p<0.01），展现了良好的生防应用潜力。

研究结论强调，SBCA作为一种高效、可靠的筛选平台，不仅能够同步评估生防菌对孢子萌发和菌丝生长的抑制能力，而且具有操作简便、通量高、重现性好等优势。该方法的建立为发掘新型生防资源提供了技术支撑，尤其对Phytophthora等以孢子为主要侵染源的病害防控具有重要意义。研究发现的两个假单胞菌株为草莓病害的生物防治提供了新的候选菌种，而SBCA平台的通用性也使其可扩展至其他作物病害系统的生防菌筛选工作中。