牛冠状病毒通过膜融合和网格蛋白介导的内吞作用进入HRT-18细胞，这一过程依赖于低pH值、动力蛋白、胆固醇、微管、Rab7和Rab11蛋白

《Journal of Virology》：Bovine coronavirus enters HRT-18 cells via membrane fusion and clathrin-mediated endocytosis in a low pH-, dynamin-, cholesterol-, microtubule-, Rab7-, and Rab11-dependent manner

牛冠状病毒（BCoV）通过膜融合和细胞吞饮（CME）进入HRT-18细胞，依赖酸性环境、dynamin、胆固醇、微管、猫hepsins、Rab7和Rab11。CavME、micropinocytosis和TMPRSS2不参与。首次揭示BCoV的进入机制。

　　### 人类冠状病毒（BCoV）感染的机制研究

人类冠状病毒（BCoV）是一种影响全球畜牧业的重要病原体，它能够同时感染呼吸系统和消化系统，导致严重的腹泻和呼吸道疾病，从而造成巨大的经济损失。为了更好地理解这种病毒的感染机制，科学家们采用了一系列实验方法，研究其在HRT-18细胞中的入侵过程。这项研究首次揭示了BCoV通过膜融合和网格蛋白介导的内吞作用（CME）进入HRT-18细胞，并且这一过程依赖于多种关键因素，如酸性环境、动力蛋白、胆固醇、微管、组织蛋白酶以及Rab7和Rab11。这些发现不仅深化了我们对BCoV病原学机制的理解，还为开发针对该病毒的新型抗病毒策略提供了理论依据。

#### 病毒入侵的关键机制

病毒入侵宿主细胞是其感染过程中的关键步骤，这一过程涉及到病毒与细胞表面受体的结合、进入细胞内部以及病毒基因组的释放。研究发现，BCoV在HRT-18细胞中的进入机制并非单一路径，而是结合了多种复杂的细胞过程。首先，酸性环境被证明是BCoV进入细胞所必需的条件。通过使用NH?Cl和氯喹（CQ）这两种内吞作用酸化抑制剂，研究团队发现它们能够显著减少病毒RNA的复制和感染效率，说明酸性环境在病毒进入过程中起到了重要作用。然而，当病毒在4°C下与细胞结合时，这两种抑制剂对病毒的吸附没有影响，表明酸性环境是病毒进入细胞的必要条件，而非吸附阶段。

其次，研究还发现动力蛋白（dynamin）是BCoV进入HRT-18细胞的关键分子之一。动力蛋白是一种GTP酶，广泛参与内吞作用，包括网格蛋白介导的内吞作用和囊泡蛋白介导的内吞作用。通过使用动力蛋白抑制剂dynasore和针对动力蛋白的siRNA技术，研究团队发现抑制动力蛋白显著降低了病毒的复制和感染效率。这表明动力蛋白在病毒进入细胞的过程中发挥了重要作用，特别是在内吞作用过程中，它通过GTP酶活性促进内吞泡的形成和分离。此外，动力蛋白的抑制并未影响病毒的吸附过程，进一步说明其主要作用是在病毒进入细胞后。

#### 网格蛋白介导的内吞作用

网格蛋白介导的内吞作用（CME）是病毒进入细胞的另一重要机制。CME是一种经典的内吞作用方式，涉及网格蛋白的聚集和内吞泡的形成。研究团队使用了氯丙嗪（CPZ）作为CME的特异性抑制剂，发现CPZ能够显著抑制BCoV的复制和进入。通过荧光显微镜观察，研究团队还发现BCoV与网格蛋白在进入过程中发生了共定位，进一步支持了CME在BCoV进入HRT-18细胞中的作用。此外，通过抑制网格蛋白的表达，研究团队也观察到病毒复制和进入显著减少，进一步确认了CME在BCoV感染中的关键作用。

#### 胆固醇的作用

胆固醇在病毒进入过程中同样扮演了重要角色。许多包膜病毒需要胆固醇来促进膜融合和内吞作用。在本研究中，通过使用甲基-β-环糊精（MβCD）这一胆固醇耗尽剂，研究团队发现胆固醇的缺失显著抑制了BCoV的进入，但对病毒的吸附没有影响。这表明胆固醇在BCoV进入细胞后，特别是在内吞作用过程中，对病毒的运输和膜融合起到了关键作用。胆固醇可能通过调节细胞膜和病毒包膜的流动性，促进病毒与细胞膜的融合，从而帮助病毒进入细胞内部。

#### 微管的作用

微管在病毒进入细胞过程中也发挥了重要作用。病毒在内吞作用后，需要通过微管进行细胞内运输，以达到病毒基因组释放的位点。研究团队使用了秋水仙素（colchicine）作为微管解聚剂，发现其能够显著抑制BCoV的进入，但不影响病毒的吸附。这表明微管的完整性对病毒的进入至关重要，可能通过提供细胞内的运输通道，帮助病毒从内吞体运输到细胞内特定的位点，以完成其复制和组装过程。

#### 组织蛋白酶的作用

组织蛋白酶是内吞体中的重要酶类，它们通过切割病毒的包膜蛋白（如S蛋白）促进膜融合。研究团队使用了E64d这一广谱组织蛋白酶抑制剂，发现其能够显著抑制BCoV的进入，但对病毒的吸附没有影响。这表明组织蛋白酶在BCoV进入细胞的过程中起到了关键作用，可能通过激活病毒的包膜蛋白，促进病毒在内吞体中的膜融合，从而释放其基因组。

#### TMPRSS2的作用

TMPRSS2是一种细胞膜上的丝氨酸蛋白酶，通常参与病毒的进入过程。然而，研究发现，使用camostat这一TMPRSS2抑制剂，对BCoV的进入和感染没有显著影响。这表明BCoV在HRT-18细胞中并不依赖TMPRSS2的活性来实现其进入机制。与其他冠状病毒不同，BCoV可能更倾向于通过内吞体中的组织蛋白酶进行膜融合，而不是在细胞膜上依赖TMPRSS2。

#### Rab蛋白的作用

Rab蛋白是调控内吞体运输的关键分子。Rab5、Rab7和Rab11分别调控早期、晚期和回收内吞体的运输过程。研究团队通过siRNA技术干扰这些Rab蛋白的表达，发现Rab7和Rab11的沉默显著抑制了BCoV的进入，而Rab5的沉默没有显著影响。这表明BCoV在进入HRT-18细胞后，需要通过Rab7和Rab11调控的内吞体运输机制，才能完成其复制和组装过程。通过激光共聚焦显微镜观察，研究团队还发现BCoV与Rab7和Rab11在进入和感染过程中发生了共定位，进一步支持了Rab蛋白在病毒运输中的作用。

#### 实验方法与技术

为了验证这些假设，研究团队采用了多种实验方法。首先，通过细胞活力实验（CCK-8）确定了各种抑制剂的安全浓度。随后，使用Western blot、RT-qPCR、TCID??和免疫荧光分析（IFA）等多种方法，评估了不同抑制剂对BCoV感染的影响。此外，通过荧光显微镜和共聚焦显微镜观察了病毒与网格蛋白、Rab蛋白的共定位情况，进一步确认了这些蛋白在病毒进入过程中的作用。研究还使用了流式细胞术和荧光显微镜，对BCoV诱导的细胞融合现象进行了定量和可视化分析，从而评估了膜融合在病毒进入中的重要性。

#### 研究的意义与应用前景

本研究首次揭示了BCoV在HRT-18细胞中的进入机制，为理解其病原学提供了新的视角。通过确定BCoV进入细胞所需的多种因素，包括酸性环境、动力蛋白、胆固醇、微管、组织蛋白酶以及Rab7和Rab11，研究为开发针对BCoV的抗病毒策略提供了潜在的靶点。例如，针对动力蛋白或Rab蛋白的抑制剂可能成为新的抗病毒药物候选，从而阻止病毒进入细胞。此外，本研究还表明，BCoV并不依赖TMPRSS2的活性，这与某些其他冠状病毒不同，为疫苗和抗病毒药物的开发提供了新的方向。

总的来说，这项研究不仅揭示了BCoV进入HRT-18细胞的具体机制，还为理解冠状病毒在不同宿主细胞中的入侵策略提供了重要参考。通过深入分析多种细胞机制和分子因素，研究为未来的抗病毒研究奠定了基础，有助于开发更有效的防控措施，以减少BCoV对全球畜牧业造成的经济损失。