TRIM47以株系依赖的方式抑制小鼠诺如病毒的复制

《Journal of Virology》：TRIM47 inhibits murine norovirus replication in a strain-dependent manner

宿主限制因子TRIM47通过抑制NS1/2前体蛋白的泛素化，特异性阻断小鼠诺如病毒CR6株的早期复制，而NS1的K91R/K119E变异可逃逸TRIM47限制。病毒复制差异与NS1遗传变异相关，机制涉及非典型去泛素化作用。

　　人类诺如病毒是全球范围内导致胃肠炎的主要病原体之一。诺如病毒具有显著的遗传多样性，这种多样性使得研究其感染机制和免疫反应变得复杂。由于诺如病毒在体外培养的难度以及缺乏小型动物模型，对遗传多样性如何影响感染和免疫的了解一直受到限制。然而，小鼠诺如病毒（MNV）已被广泛用作研究诺如病毒生物学的模型系统。在本研究中，我们发现TRIM47是一种宿主限制因子，能够以种系依赖性的方式显著抑制MNV的感染。具体而言，TRIM47的表达抑制了MNV CR6株（MNV^CR6）生命周期的早期阶段，而对密切相关的MNV CW3株（MNV^CW3）的复制则没有明显影响。MNV^CW3会导致急性感染，其传播范围超出肠道组织，并且对免疫缺陷小鼠具有致死性。相比之下，MNV^CR6无法扩散到全身组织，但能够在肠道绒毛细胞中建立持续性感染。通过正向遗传筛选，我们发现NS1非结构蛋白的遗传变异是导致MNV株系对TRIM47敏感性差异的关键因素。虽然大多数包含TRIM结构域的蛋白通过泛素化和降解其靶标来发挥抗病毒作用，但TRIM47既不促进也不导致NS1/2前体蛋白的泛素化和降解。相反，TRIM47通过促进NS1/2的去泛素化来发挥抗病毒功能。这一发现为理解潜在的抗病毒基因以及诺如病毒进化过程中可能影响病毒嗜性（tropism）的机制提供了新的视角。

病毒的遗传多样性对感染结果有着深远的影响。研究这种多样性如何影响病毒传播、致病性和免疫反应，对于预测新兴病毒及其变异体至关重要。尽管诺如病毒具有高度的遗传多样性，但人类诺如病毒在体外培养方面仍然存在技术障碍，这限制了对其遗传差异的研究。小鼠诺如病毒则因其在细胞系、原代细胞和实验室小鼠中的高效复制而成为研究诺如病毒生物学的重要模型。MNV不仅能够模拟人类诺如病毒的许多特征，如基因组结构、RNA表达机制、粪-口传播、肠道复制和粪便排泄，还被用于研究病毒持续性、固有的先天免疫、细菌与病毒的相互作用、免疫系统发育以及微生物引发的炎症性疾病等。尽管MNV与人类诺如病毒在某些方面存在差异，例如小鼠无法呕吐、感染通常不导致腹泻，以及MNV编码额外的开放阅读框，但这些模型仍然提供了重要的研究价值。

尽管MNV在体外复制时表现出较少的遗传多样性，但在体内感染时却呈现出显著的感染结果差异。例如，典型的MNV株系MNV^CW3和MNV^CR6在基因组水平上具有86%的同源性，但它们在体内的表现却大相径庭。MNV^CW3会导致急性感染，其传播范围超出肠道组织，并且对免疫缺陷小鼠具有致死性。而MNV^CR6则无法扩散到全身组织，但能够在肠道绒毛细胞中建立持续性感染。这一现象表明，尽管MNV株系在体外复制时表现出相似性，但在体内感染时，其感染能力和传播范围存在显著差异。这种差异可能是由病毒基因组中某些关键区域的变异所导致，而这些区域在体外无法被充分检测到。

为了探究这种差异的分子基础，我们利用基因组范围的CRISPR激活筛选技术，识别了对MNV^CR6和MNV^CW3感染具有限制作用的宿主基因。在这些基因中，TRIM47引起了我们的特别关注。TRIM47是一种E3泛素连接酶，但其在MNV^CR6感染中的作用与传统抗病毒TRIM蛋白不同。我们发现，TRIM47的过表达能够显著抑制MNV^CR6的感染，但对MNV^CW3则没有明显影响。进一步的实验表明，NS1非结构蛋白的遗传变异是导致这种差异的关键因素。尽管TRIM47与NS2和NS1/2前体蛋白存在相互作用，但与NS1的直接相互作用并未被检测到。这一结果提示，TRIM47的抗病毒作用可能并非依赖于直接的蛋白质-蛋白质相互作用，而是通过调控NS1/2的泛素化状态来实现。

TRIM47的抗病毒机制与传统的TRIM蛋白有所不同。大多数TRIM蛋白通过泛素化和降解病毒蛋白来抑制病毒感染，但TRIM47的作用机制似乎更复杂。我们发现，TRIM47并不促进NS1/2的泛素化和降解，而是通过去泛素化来抑制MNV^CR6的复制。这一机制的发现为理解宿主限制因子如何影响病毒复制提供了新的思路。此外，TRIM47的抗病毒作用似乎依赖于其E3泛素连接酶功能，因为其RING结构域的突变会显著削弱其对MNV^CR6的抑制能力。然而，TRIM47对NS1/2的去泛素化作用并未在感染过程中被直接观察到，这可能是因为在感染条件下，NS1/2的水平较低，使得其泛素化状态难以被检测到。因此，进一步的研究需要在感染条件下验证NS1/2的泛素化状态及其对病毒复制的影响。

尽管TRIM47的抗病毒作用依赖于NS1的遗传变异，但其作用机制并非完全由NS1的加工过程决定。我们测试了NS1/2是否因宿主蛋白酶（如caspase-3）的加工而影响其对TRIM47的敏感性。然而，结果表明，NS1/2的加工程度对TRIM47的抑制作用没有显著影响。这一发现提示，TRIM47的抗病毒作用可能涉及NS1和NS2之间的复杂相互作用，而不仅仅是NS1本身的特性。此外，TRIM47与NS2的相互作用在多种实验条件下均被观察到，这表明NS2在TRIM47的抗病毒机制中可能扮演重要角色。

本研究的发现对于理解诺如病毒的遗传多样性及其对宿主限制因子的响应具有重要意义。TRIM47的抗病毒作用依赖于其E3泛素连接酶功能，但其具体作用机制可能涉及去泛素化过程，而非传统的泛素化和降解。这一发现不仅揭示了TRIM47作为抗病毒基因的潜力，还为探索诺如病毒进化过程中可能影响其宿主适应性和传播能力的机制提供了新的方向。此外，本研究的结果也为开发针对诺如病毒的新型抗病毒策略提供了理论基础，特别是在针对特定病毒株系的靶向治疗方面。

尽管本研究在分子机制方面取得了一些进展，但仍存在一些局限性。首先，我们主要依赖TRIM47的过表达来研究其抗病毒作用，而未评估内源性TRIM47的影响。这可能导致对TRIM47在生理条件下的作用机制理解不够全面。其次，由于MNV^CR6在TRIM47表达细胞中的蛋白水平较低，我们无法在感染条件下直接观察其泛素化和降解过程。因此，进一步的研究需要结合感染模型和分子生物学技术，以更全面地揭示TRIM47的抗病毒机制。此外，尽管我们识别了多个可能的逃逸突变，但仅关注了其中的两个突变（K91R和K119E）。未来的研究需要更系统地分析这些突变的分子机制，以揭示它们如何影响病毒对TRIM47的敏感性。

综上所述，本研究揭示了TRIM47作为宿主限制因子在MNV感染中的关键作用。TRIM47通过调控NS1/2的泛素化状态，以种系依赖性的方式抑制MNV^CR6的复制，但对MNV^CW3则无明显影响。这一发现不仅加深了我们对诺如病毒遗传多样性的理解，还为探索宿主与病毒之间的相互作用提供了新的视角。未来的研究可以进一步探讨TRIM47与NS1/2之间的具体相互作用机制，以及这些机制如何影响病毒的感染和传播。此外，研究TRIM47在不同宿主中的作用，以及其在人类诺如病毒感染中的潜在应用，将有助于开发更有效的抗病毒策略。