针对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的七种噬菌体的分离与基因组分析

《Microbiology Resource Announcements》：Isolation and genomic analysis of seven phages active against carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

从美国罗切斯特市政污水中分离出7株对产超广谱β-内酰胺酶的铜绿假单胞菌（CRKP）裂解的噬菌体，分别属于Ackermannviridae、Drexlerviridae和Zobellviridae科，基因组中未发现耐药或毒力相关基因。

　　这项研究报道了从美国明尼苏达州罗切斯特市的市政污水中分离出的七种噬菌体的基因组序列。这些噬菌体以携带blaKPC基因的Klebsiella pneumoniae菌株为宿主，属于裂解型噬菌体，并且被归类到Ackermannviridae、Drexlerviridae和Zobellviridae三个不同的病毒家族中。值得注意的是，它们的基因组中并未发现已知的抗微生物耐药性（AMR）或毒力基因，这一发现对于探索新型抗菌疗法具有重要意义。

Klebsiella pneumoniae是一种常见的革兰氏阴性菌，尤其在医院环境中，它可能导致难以治疗的感染，特别是在免疫系统受损的患者中。近年来，由于全球抗微生物耐药性（AMR）的上升以及新抗生素研发的进展缓慢，CRKP（碳青霉烯类耐药K. pneumoniae）对公共卫生构成了严重威胁。因此，寻找替代性的抗菌策略成为迫切需求。噬菌体疗法作为一种潜在的解决方案，因其特异性高、可避免对宿主细胞的伤害以及能够克服细菌耐药性等优点而受到关注。本次研究中，科学家们成功从单一的市政污水样本中分离出七种具有裂解活性的噬菌体，它们能够针对CRKP发挥作用，为开发噬菌体疗法提供了新的资源。

为了确保这些噬菌体的有效性和安全性，研究人员采用了严格的分离和表征方法。首先，通过使用特定的K. pneumoniae临床菌株进行富集，然后利用双层琼脂覆盖法对单个噬菌斑进行纯化。这一过程至少重复了三次，以确保获得的噬菌体样本具有较高的纯度和一致性。随后，通过DNA酶I和RNA酶A处理，去除了样本中的宿主DNA和RNA，从而确保了噬菌体基因组的准确性。基因组的提取使用了两种不同的商业试剂盒：Quick-DNA Viral Kit和Maxwell? RSC Blood DNA Kit，以提高实验的可靠性和重复性。

在基因组测序方面，研究人员采用了Illumina平台进行高通量测序，使用了DNA Prep tagmentation kit和Unique Dual Indexes技术，以生成2×150 bp的配对末端读数。这些原始数据经过Trimmomatic工具进行修剪处理，并使用FastQC工具进行质量评估。为了进行基因组的组装，研究人员使用了metaviralSPAdes软件，该软件专为病毒基因组的拼接设计，能够有效处理高复杂度的病毒序列。组装后的基因组通过Quast工具进行质量检查，以确保其完整性和准确性。随后，使用Pharokka工具对基因组进行注释，以识别潜在的功能基因和结构特征。

在进一步的分析中，研究人员利用ABRicate工具对噬菌体基因组进行了抗微生物耐药性（AMR）和毒力基因的筛查。结果表明，这些噬菌体基因组中未检测到已知的耐药性或毒力相关基因，这表明它们可能不会对宿主细胞或其他微生物产生不良影响。此外，为了确定噬菌体基因组的末端结构，研究人员使用了PhageTerm工具，发现所有噬菌体的基因组末端均具有冗余性，这可能与噬菌体的复制机制和基因组稳定性有关。

为了更好地理解这些噬菌体的进化关系和分类地位，研究人员进行了系统发育分析。通过NCBI Nucleotide BLAST搜索，他们获取了每种噬菌体最相似的十个完整序列，并利用VICTOR工具构建了系统发育树。结果表明，这些噬菌体主要分布在Caudovirales目下的Ackermannviridae、Drexlerviridae和Zobellviridae三个家族中。其中，vB_KpnM-Zahir和vB_KpnM-Bestiario属于Ackermannviridae家族，而vB_KpnS-Cronopio、vB_KpnS-Fama、vB_KpnS-Tlon和vB_KpnS-Uqbar则属于Drexlerviridae家族。vB_KpnP-Asterion被归类为Zobellviridae家族。值得注意的是，对于vB_KpnP-Asterion，taxMyPhage分析提示其可能代表一个全新的物种和属，这表明该噬菌体在分类学上具有独特性。

此外，研究人员还利用负染色透射电子显微镜（TEM）对这些噬菌体的形态进行了观察。结果显示，这些噬菌体主要表现出三种不同的形态：myophage（尾部结构的噬菌体）、sipho-phage（细长的噬菌体）和podophage（具有粘性尾部的噬菌体）。其中，myophage和sipho-phage各占2种，而podophage仅有一种。这种形态的多样性可能反映了噬菌体在进化过程中适应不同宿主环境的能力。

在基因组的结构和功能分析中，研究人员发现这些噬菌体的基因组大小在45,921 bp到160,669 bp之间，GC含量在45.80%到47.43%之间。这些参数对于理解噬菌体的遗传特性、复制机制以及宿主特异性具有重要意义。例如，较高的GC含量通常与更复杂的基因组结构和更高效的基因表达相关，而较低的GC含量可能意味着噬菌体在宿主环境中具有更强的适应性。

为了进一步验证这些噬菌体的裂解活性，研究人员进行了详细的实验分析。他们通过不同的宿主菌株测试了这些噬菌体的裂解能力，并发现它们在所有测试的CRKP菌株中均表现出强烈的裂解活性。这一结果表明，这些噬菌体具有广泛的宿主范围，可能在对抗不同类型的CRKP感染中发挥重要作用。同时，它们的裂解活性也意味着它们能够有效地破坏目标细菌，而不会对其他微生物造成不必要的影响。

考虑到这些噬菌体的潜在应用价值，研究人员还对它们的生活方式进行了预测。通过PhageAI工具分析，所有七种噬菌体均被评分≥99.7%为病毒性生活方式，这表明它们具有强烈的裂解特性，而非温和型或共生型。这种特性对于噬菌体疗法的开发至关重要，因为裂解型噬菌体能够直接杀死目标细菌，而不会产生耐药性或副作用。

为了进一步了解这些噬菌体的遗传特征和进化关系，研究人员还进行了详细的注释分析。Pharokka工具不仅能够识别基因的功能，还能提供基因的结构信息，如启动子、终止子、调控元件等。这些信息对于理解噬菌体的生命周期、复制机制以及与宿主的相互作用具有重要意义。此外，通过比较基因组学分析，研究人员能够识别这些噬菌体与其他已知噬菌体之间的同源性，从而为后续的基因工程改造提供理论依据。

在系统发育分析中，研究人员利用了NCBI数据库中的大量已知噬菌体序列，构建了详细的系统发育树。这一分析不仅帮助确定了这些噬菌体的分类地位，还揭示了它们与其他噬菌体之间的亲缘关系。例如，vB_KpnM-Zahir和vB_KpnM-Bestiario与Ackermannviridae家族的其他成员具有较高的相似性，而vB_KpnS-Cronopio、vB_KpnS-Fama、vB_KpnS-Tlon和vB_KpnS-Uqbar则与Drexlerviridae家族的成员表现出密切的亲缘关系。vB_KpnP-Asterion虽然被归类为Zobellviridae家族，但其与该家族其他成员的相似性较低，可能表明它在进化过程中经历了独特的适应过程。

除了系统发育分析，研究人员还对这些噬菌体的基因组结构进行了深入研究。通过PhageTerm工具，他们发现这些噬菌体的基因组末端具有冗余性，这可能意味着它们的基因组在复制过程中存在一定的灵活性，能够适应不同的宿主环境。然而，对于某些噬菌体，如vB_KpnM-Zahir和vB_KpnM-Bestiario，研究人员能够更精确地确定其基因组末端的位置，这为理解其复制机制提供了重要线索。

在实际应用方面，这些噬菌体可能具有广泛的潜力。由于它们能够有效裂解CRKP，且不携带已知的抗微生物耐药性或毒力基因，因此它们可能成为开发新型抗菌药物的重要资源。此外，它们的形态多样性也意味着它们可能适用于不同的治疗场景，例如针对特定的细菌感染或宿主环境。然而，尽管这些噬菌体表现出良好的裂解活性，研究人员仍建议进一步的实验验证，以确保它们在实际应用中的安全性和有效性。

在实验方法的细节上，研究人员采用了多种先进的技术和工具，以确保数据的准确性和可靠性。例如，他们使用了Illumina平台进行高通量测序，这一技术具有高灵敏度和高通量的特点，能够快速、准确地获取大量基因组数据。此外，他们还使用了Trimmomatic和FastQC工具对原始数据进行预处理和质量评估，以确保后续分析的准确性。在基因组组装过程中，metaviralSPAdes软件被用于处理复杂的病毒序列，而Quast工具则用于评估组装结果的质量。这些工具的使用不仅提高了实验的效率，还确保了数据的准确性和完整性。

在基因组注释和功能分析方面，研究人员利用了Pharokka工具，该工具能够对病毒基因组进行自动注释，并识别关键的功能基因。此外，ABRicate工具被用于筛查抗微生物耐药性（AMR）和毒力基因，以确保这些噬菌体不会对宿主或环境造成不良影响。这些分析结果表明，这些噬菌体在基因组层面具有较高的安全性，可能在未来的抗菌治疗中发挥重要作用。

最后，研究人员还对这些噬菌体的命名进行了说明。它们的名称灵感来源于两位著名作家Julio Cortázar和Jorge Luis Borges的作品，这一命名方式不仅体现了科学探索的创意性，还增加了这些噬菌体在学术和公众中的辨识度。此外，研究人员还感谢了多个机构和人员的支持，包括ARLG实验室中心、Mayo Clinic的临床微生物学实验室以及SeqCoast Genomics公司提供的测序服务。这些合作对于研究的顺利进行起到了关键作用。

综上所述，这项研究不仅揭示了从市政污水中分离出的七种噬菌体的基因组特征，还为开发针对CRKP感染的新型噬菌体疗法提供了重要的基础数据。这些噬菌体的广泛宿主范围、高裂解活性以及基因组的高安全性，使得它们成为对抗多重耐药细菌的潜在候选。未来的研究可以进一步探索这些噬菌体的生物学特性、宿主特异性以及在实际应用中的潜力，以推动噬菌体疗法的发展和应用。