同种异体造血细胞移植通过CD8+ T细胞诱发小鼠动脉粥样硬化

《Cardiovascular Research》：Allogeneic hematopoietic cell transplantation initiates atherosclerosis in mice via CD8+ T cells

本研究针对接受同种异体造血细胞移植（allo-HCT）患者心血管事件风险增加但机制不明的临床问题，通过建立次要组织相容性抗原（miHAg）不匹配的小鼠模型，首次证实allo-HCT通过CD8+ T细胞驱动动脉粥样硬化进展。研究发现移植骨髓和T细胞（BMT）可诱导亚临床移植物抗宿主病（GvHD），显著增加主动脉斑块负荷和血清胆固醇水平，而CD8+ T细胞耗竭可逆转该现象。该研究为allo-HCT幸存者心血管并发症提供了机制解释，并提示CD8+ T细胞为潜在治疗靶点。

　　

在血液系统恶性肿瘤的治疗领域，同种异体造血细胞移植（allo-HCT）犹如一把双刃剑。它虽为患者带来生机，却也可能引发一种棘手的并发症——移植物抗宿主病（GvHD）。更令人担忧的是，长期存活的患者面临着心血管事件发生率显著增加的阴影，其风险可达普通人群的两倍以上。然而，这背后的生物学机制一直笼罩在迷雾之中：究竟是GvHD直接导致了血管损伤，还是其他因素在作祟？这个问题在学术界仍存争议。动脉粥样硬化作为心血管疾病的病理基础，本质上是一种慢性炎症性疾病，免疫细胞在其中扮演着关键角色。尤其值得注意的是，细胞毒性CD8⁺ T细胞已被证明能够促进动脉斑块的不稳定性。那么，在allo-HCT的复杂背景下，供者来源的免疫细胞，特别是CD8⁺ T细胞，是否会加速受体动脉粥样硬化的进程？为了解开这个谜团，由Ivana Jorgacevic、Haroon Shaikh、Alma Zernecke和Andreas Beilhack等领导的研究团队进行了一项开创性的研究，其成果发表在心血管研究领域的权威期刊《Cardiovascular Research》上。

研究人员为回答上述问题，主要采用了以下几种关键技术方法：研究构建了次要组织相容性抗原（miHAg）不匹配的allo-HCT小鼠模型，以动脉粥样硬化易感的低密度脂蛋白受体缺陷（Ldlr^-/-）C57BL/6小鼠为受体，移植BALB/b供体的骨髓（BM）或骨髓加脾脏T细胞（BMT）。通过流式细胞术和单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析了主动脉等组织的免疫细胞浸润和基因表达谱。采用抗体耗竭技术特异性清除CD8⁺ T细胞以验证其功能。利用组织病理学染色（如Oil-Red-O、Aldehyde-fuchsin）定量分析主动脉和主动脉根部的动脉粥样硬化病变。并对血清脂质水平及肝脏胆固醇代谢相关基因表达进行了检测。

3.1 亚临床GvHD加重动脉粥样硬化

为了探究GvHD与动脉粥样硬化是否存在关联，研究团队建立了一种主要组织相容性复合体（MHC）匹配但miHAg不匹配的allo-HCT小鼠模型。研究人员对C57BL/6 Ldlr^-/-（B6.Ldlr^-/-）小鼠进行清髓性照射后，分别移植BALB/b供体的骨髓细胞（BM组）或骨髓加T细胞（BMT组）。移植后10天开始喂食西方饮食（WD）以诱导动脉粥样硬化。

结果发现，BMT组小鼠仅出现轻微的临床GvHD症状，且典型GvHD靶器官（如皮肤、肝脏、小肠和结肠）的组织病理学评分与BM组相比无显著差异，表明疾病活动度低，处于亚临床状态。然而，在动脉粥样硬化评估中，情况却大不相同。喂食WD的BMT组小鼠，其主动脉弓、全部主动脉以及主动脉根部的动脉粥样硬化病变面积均显著大于仅接受BM移植的小鼠。同时，BMT组小鼠表现出更高的血清总胆固醇水平，具体表现为极低密度脂蛋白（VLDL）胆固醇水平升高和高密度脂蛋白（HDL）胆固醇水平降低，提示载脂蛋白B（ApoB）脂蛋白负荷过重。而甘油三酯水平未受影响。作为对照，同基因移植（syn-HCT，即B6→B6.Ldlr^-/-）实验中，BM组和BMT组小鼠的动脉粥样硬化病变和胆固醇水平均无差异。这些数据表明，即使没有明显的临床GvHD症状，异基因T细胞的引入也能在西方饮食挑战下，特异性地加重动脉粥样硬化并引起血脂异常。

3.2 亚临床GvHD局部影响主动脉T细胞

为了深入理解斑块细胞组成的变化，研究人员对动脉粥样硬化病变进行了详细分析。免疫组化显示，斑块内Mac-2⁺巨噬细胞和αSMA⁺血管平滑肌细胞的相对含量、胶原含量以及坏死核心大小在两组间无显著差异。但流式细胞术检测发现，BMT组小鼠主动脉中CD3⁺ T细胞（包括CD4⁺和CD8⁺ T细胞）的频率升高，且其中CD8⁺ T细胞表达更高的活化标志CD44。

随后，团队对从主动脉分离的CD45⁺白细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。分析结果显示，BMT组小鼠主动脉的CD8⁺ T细胞在基因表达上呈现出明显的活化状态。与BM组相比，BMT组的CD8⁺ T细胞高表达与细胞活化（如Nfatc1, Il7r, Il2rb, Cd44）、细胞毒性T细胞分化（Tnfrsf9, Traf1）及细胞毒性功能（Gzmb, Fasl, Tnfsf10）相关的基因，以及炎症细胞因子Tnf和多种趋化因子受体（Ccr2, Ccr5, Cxcr4, Cxcr6）。而BM组的CD8⁺ T细胞则高表达与分化相关的基因（如Tcf7, Sox4）。这些发现在蛋白水平上得到了光谱流式细胞术的验证：BMT组主动脉CD8⁺ T细胞中颗粒酶B（Granzyme B）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、Fas配体（FasL）和CD44等效应分子表达显著增加。在系统免疫反应方面，两组小鼠的白细胞计数、脾脏重量、淋巴结细胞数、单细胞水平以及T细胞、B细胞的主要亚群和分化状态在血液、脾脏中大多相似。然而，BMT组小鼠肠系膜和外周淋巴结中调节性T细胞（Tregs， Foxp3⁺ CD25⁺ CD4⁺）的频率降低。此外，研究还发现清髓性照射可调变血管内皮的免疫表型，下调主要组织相容性复合体I类分子（MHCI），上调整合素α亚基（CD49b, CD49d, CD49e），这可能增强了免疫细胞招募的能力。这些数据表明，BMT移植加剧动脉粥样硬化病变与主动脉局部活化CD8⁺ T细胞浸润增加，以及淋巴结中常规T细胞扩增和Tregs减少相关。

3.3 亚临床GvHD-动脉粥样硬化与肝损伤无关，但伴随降低胆固醇的代偿通路上调

肝脏是胆固醇代谢的核心器官，也是GvHD的主要靶器官。组织学评估显示，BM组和BMT组小鼠的肝脏仅存在轻度再生、星状细胞活化及炎症迹象，且无组间差异。但血清肝酶天冬氨酸转氨酶（AST）水平在BMT组显著升高，丙氨酸转氨酶（ALT）有轻度升高趋势，提示存在轻度肝损伤；总胆红素水平无变化。

鉴于BMT组血清胆固醇升高，研究人员检测了肝脏胆固醇合成与清除相关基因的表达。发现BMT组肝脏中，胆固醇合成的关键限速酶HMG-CoA还原酶（Hmgcr）及其主要转录调控因子SREBP2（Srebf2）的mRNA表达下调。同时，负责将胆固醇外排至载脂蛋白A-I（ApoA-I）的转运蛋白ABCA1（Abca1），以及参与将肝胆固醇排泄到胆汁的转运蛋白ABCG5（Abcg5）和ABCG8（Abcg8，有上调趋势）的表达均上调。此外，胆固醇经典胆汁酸合成途径的关键酶Cyp7a1的mRNA表达也升高。这些变化共同指向肝脏启动了一种代偿性机制，试图降低细胞内胆固醇水平。另一方面，参与乳糜微粒残余物清除的低密度脂蛋白受体相关蛋白1（Lrp1）的表达在BMT组显著降低，而极低密度脂蛋白受体（Vldlr）表达不变。参与脂蛋白合成的乙酰辅酶A乙酰转移酶1（Acat1）有上调趋势。这些变化（Lrp1降低和Acat1升高）可能共同导致了血浆胆固醇水平的升高。而粪便中的胆固醇含量在两组间无差异，表明胆固醇的丢失或肠道重吸收没有显著变化。综上，亚临床GvHD背景下，动脉粥样硬化的加重伴随着轻度肝损伤和肝脏降低胆固醇水平的代偿通路激活。

3.4 CD8⁺ T细胞耗竭减轻动脉粥样硬化

由于上述发现提示BMT移植小鼠的动脉粥样硬化病变与活化的异基因CD8⁺ T细胞密切相关，研究团队接下来通过抗体耗竭实验直接验证CD8⁺ T细胞的功能作用。

B6.Ldlr^-/-小鼠在接受BALB/b BMT移植后，从移植后第10天开始喂食WD，并每周注射抗CD8β单克隆抗体（抗CD8β组）或同型对照抗体（同型对照组），持续8周。结果证实，抗CD8β抗体处理有效降低了脾脏中的CD8⁺ T细胞数量，且不影响临床GvHD评分或体重变化。重要的是，与同型对照组相比，抗CD8β抗体处理显著减少了BMT移植小鼠主动脉和主动脉根部的动脉粥样硬化病变面积。此外，病变分析显示，CD8⁺ T细胞耗竭后，斑块脆弱性指数降低，提示斑块可能更趋于稳定。尤为关键的是，CD8⁺ T细胞耗竭显著降低了BMT移植小鼠的血清胆固醇水平，但对甘油三酯无影响。而在仅移植BM（不包含T细胞）的小鼠中，CD8⁺ T细胞耗竭虽也部分减少了主动脉（非主动脉根）的病变，但并未影响胆固醇水平。这一对比表明，异基因CD8⁺ T细胞反应是BMT移植引起高胆固醇血症和动脉粥样硬化加重的主要原因。

5. 讨论与结论

本研究通过建立一种新颖的miHAg不匹配allo-HCT小鼠模型，首次提供了实验证据，证明allo-HCT本身，特别是伴随的亚临床GvHD，能够加速动脉粥样硬化的进展。其核心机制是供者来源的CD8⁺ T细胞被激活，通过双重途径发挥作用：其一，通过影响肝脏（可能作为GvHD靶器官）的胆固醇代谢，导致血清胆固醇水平升高，特别是VLDL水平上升和HDL水平下降，创造了致动脉粥样硬化的脂质环境；其二，这些活化的CD8⁺ T细胞直接浸润主动脉壁，发挥其细胞毒性和促炎效应，直接促进斑块的形成和发展。CD8⁺ T细胞耗竭实验逆转了动脉粥样硬化加重和高胆固醇血症的现象，强有力地证实了CD8⁺ T细胞在此过程中的核心驱动作用。

该研究的发现具有重要的临床意义。它为allo-HCT长期幸存者中观察到的心血管疾病发病率增加的现象提供了全新的机制性解释，将关注点引向了移植免疫反应本身。研究结果表明，即使没有典型的重度GvHD临床表现，亚临床的免疫攻击也可能对心血管系统产生深远影响。这提示对于接受allo-HCT的患者，无论GvHD临床活动度如何，都应高度重视心血管风险的监测与管理。更重要的是，本研究将CD8⁺ T细胞确立为GvHD相关动脉粥样硬化的关键介质，这为开发针对性的预防和治疗策略提供了潜在的靶点。例如，探索在控制GvHD的同时，如何特异性调节或靶向致病性CD8⁺ T细胞亚群，可能有助于在抗肿瘤免疫和心血管保护之间找到平衡点。

总之，这项研究不仅深化了对allo-HCT晚期并发症病理生理过程的理解，而且为改善患者长期生存质量开辟了新的研究方向。它所建立的动物模型也为后续深入研究GvHD诱导动脉粥样硬化的信号通路和筛选干预措施提供了宝贵的平台。