《Aquaculture》：The role of ribosomal protein RPL35A in heme regulation and hematopoiesis in the blood clam
Anadara granosa
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血红素浓度调控基因Ag-Rpl35a在血蛤红细胞发育和血红素合成中起关键作用，RNAi验证显示其敲低显著降低红细胞总数、血红蛋白浓度和血红素水平，且通过影响铁代谢相关基因表达实现调控。
张梦诗|廖玉山|林志华|何欣|鲍永波
中国浙江省万里大学生物与环境科学学院，浙江省水生种质资源重点实验室，宁波315100
摘要
血蛤（Anadara granosa）是一种具有经济价值的双壳类动物。血蛤体内富含血红素的血液是铁的宝贵食物来源。然而，调控血红素浓度的遗传机制尚不清楚。我们受到Ag-Rpl35a基因全基因组关联信号的启发，研究了这种核糖体蛋白（RPL35A）是否在血红素生成和红细胞特征中起作用，通过检测其在发育过程中的表达水平以及其在血细胞中的分布情况。我们使用RNA干扰（RNAi）技术测定了总血细胞计数（THC）、血红蛋白浓度（HC）和血红素浓度（HEME）。基因分型结果显示，Ag-Rpl35a基因杂合个体的血红素浓度明显高于纯合个体，表明Ag-Rpl35a在调控血红素浓度中起着重要作用。Ag-Rpl35a在早期发育阶段和血细胞中的表达水平高于野生型，其蛋白质主要定位于细胞质和细胞核中。功能验证表明，Ag-Rpl35a的敲低导致THC、HC和HEME水平降低。这表明Ag-Rpl35a在血红素生成和血细胞发育中起关键作用。我们的研究结果共同支持核糖体蛋白RPL35A在双壳类动物中调控血红素的作用，为通过基因手段提高A. granosa的血红素浓度提供了理论依据。
引言
血蛤（Anadara granosa）是帘蛤科（Arcidae）的代表性物种，具有重要的经济价值。A. granosa主要分布于印度-太平洋地区，栖息在河口和沿海环境的泥质或沙质底质中，常见于浅海的潮间带或亚潮间带（Yang等人，2023年）。血蛤的血液呈红色，这在双壳类动物中较为罕见。这种红色是由于血液中含有血红蛋白，而血红蛋白中的血红素基团与其结合的铁离子共同作用的结果（Zhang等人，2023年）。同一血蛤种群内的血红蛋白浓度存在显著差异。血红蛋白水平较高的个体通常血液颜色更深，对疾病的抵抗力更强，营养价值也更高（Yang等人，2023年；He等人，2024b年）。总血细胞计数（THC）、血红蛋白浓度（HC）和血红素浓度（HEME）是定义血蛤红细胞特征（RBTs）的关键参数。此外，单个血蛤体内的HC水平与THC和HEME水平呈强正相关，反映了造血作用在塑造RBTs中的核心作用。多种关键因子（如、、和）通过影响造血细胞的增殖和分化以及个体的RBTs来调节血液中的血红蛋白积累和携氧能力（Jin等人，2024a年，Jin等人，2024b年；Wang等人，2025a年，Wang等人，2025b年，Wang等人，2025c年）。
我们之前在一项全基因组关联研究（GWAS）中发现Ag-Rpl35a附近的一个单核苷酸多态性（SNP）位点与血蛤中的血红素浓度相关（He等人，2024b年），这促使我们进一步研究该基因。由RPL35A编码的核糖体大亚基蛋白L35a在红细胞增殖和分化中起关键作用（Danilova等人，2008年；Narla和Ebert，2010年）。例如，在Diamond-Blackfan贫血患者中，RPL35A的杂合突变会导致28S rRNA的异常处理，从而引发红细胞前体细胞的凋亡（Farrar等人，2008年，Farrar等人，2014年）。这一过程与其他核糖体蛋白基因中的半合子突变类似，这些突变常与红细胞谱系的发育异常相关（Gripp等人，2014年；Liu和Karlsson，2024年）。这些发育异常的机制涉及60S核糖体亚基的组装受损以及p53通路的激活（James等人，2014年；Ellis，2014年；Kang等人，2021年）。Rpl35a基因是核糖体的组成部分；Rpl35a的功能障碍会通过影响蛋白质合成和细胞稳态而导致细胞功能障碍。RPL35A可能通过调控红细胞合成的蛋白质来影响血红素的合成和正常红细胞的发育。这一机制已在脊椎动物模型中得到验证；然而，在无脊椎动物中的研究较少。需要进一步研究以确定Ag-Rpl35a是否在其他物种（如血蛤）的RBTs中发挥类似作用。
我们研究了Ag-Rpl35a在造血组织中的表达分布和定位。我们使用RNA干扰（RNAi）、EdU染色、免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）技术来探讨Ag-Rpl35a敲低对血蛤的HC和HEME、血细胞增殖以及铁代谢的影响。我们的目标是确定Ag-Rpl35a在无脊椎动物RBTs中的功能作用，加深对血红素调控网络的理解，并为培育高血红素含量的血蛤品种提供分子层面的理论支持。
材料
我们使用了来自中国浙江省宁海县水产养殖场的2岁成年A. granosa个体。这些血蛤在实验室水族箱中适应了7天，期间通过曝气保持溶解氧的供应，并每天早晚喂食浓缩的小球藻颗粒。水温维持在22±0.5°C，盐度为25±0.5‰。选择的血蛤具有丰满的闭壳肌和较强的闭壳能力。
ag-Rpl35a的结构预测和表达特征
系统发育和基序分析表明，Ag-Rpl35a在软体动物（如血蛤和牡蛎）和脊椎动物中高度保守。其编码的蛋白质包含Ribosomal_L35Ae结构域，该结构域由参与60S核糖体亚基组装的保守基序1和2组成。基序3仅存在于软体动物中，目前尚未被赋予已知的功能结构。基因组研究表明，基序3是一种物种特异性的结构变异。
讨论
我们系统验证了Ag-Rpl35a在血蛤红细胞特征（RBTs）中的作用。系统发育和基序分析显示，Ag-Rpl35a在软体动物和脊椎动物中高度保守。基序1和2的稳定存在表明它们在维持基本核糖体功能中起着关键作用，这与核糖体蛋白L35Ae家族在翻译过程中的核心作用一致（Ban等人，2014年）。基序3仅存在于软体动物中，目前尚未明确其功能。
结论
我们系统研究了Ag-Rpl35a在血蛤血液特征发育中的作用。通过表达谱分析、免疫定位、RNAi和分子检测，我们发现Ag-Rpl35a在鳃等造血组织中高表达。研究发现Ag-Rpl35a主要定位于基质细胞的细胞质区域。功能验证表明，抑制Ag-Rpl35a的表达显著降低了THC、HC和HEME的水平。
CRediT作者贡献声明
张梦诗：撰写初稿，数据可视化。廖玉山：数据可视化，实验研究。林志华：概念构思。何欣：撰写、审稿与编辑，实验研究，资金筹集。鲍永波：撰写、审稿与编辑，资金筹集，概念构思。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（32273123）、浙江省自然科学基金（ZCLZ25C0401）、浙江省重大科技计划（2021C02069-7）、宁波市自然科学基金（2023J042）、永江河流域科技创新重点研发计划（2025Z092）、浙江省自然科学基金（LQN25C190004）以及浙江省生物工程顶级学科（A类）的财政支持。
