ABE发酵的数学建模：基因敲除及增强措施对溶剂产量的影响

《Bioresource Technology Reports》：Mathematical modeling of ABE fermentation: Effects of gene knockouts and enhancements on solvent production

本研究建立了两种Clostridium acetobutylicum菌株（ATCC 55025和824）的ABE发酵动力学模型，分析HK基因敲除及与其他代谢途径基因协同调控对但anol生产的影响，通过非参数自助法验证模型可靠性，揭示了pH调控与基因修饰的协同作用机制。

　　生物燃料在当今能源结构中的重要性日益凸显，尤其是随着全球对可持续能源需求的增长，生物丁醇（biobutanol）作为一种具有较高能量密度和较低挥发性的替代燃料，展现出广阔的应用前景。然而，其大规模经济生产仍面临诸多挑战，其中最突出的问题包括低产物浓度、生产过程中的产物抑制以及复杂的代谢调控机制。为了克服这些障碍，研究者们正在探索通过基因工程手段对产生丁醇的细菌——如梭菌（Clostridium）物种进行改造，以提高丁醇的产量和生产效率。

在梭菌的代谢过程中，酸ogenic（酸生成）和solventogenic（溶剂生成）阶段的转换是影响丁醇产量的关键因素。酸生成阶段主要通过将葡萄糖转化为乙酸、丁酸和少量乳酸，同时伴随pH值的下降。这一pH值的降低会触发细胞代谢从酸生成向溶剂生成的转变，从而促进丁醇、乙酸和丙酮的生成。然而，pH值的剧烈变化也可能对细胞产生负面影响，例如在pH值低于4的情况下，会完全阻止孢子形成并抑制关键基因的表达。因此，如何在不影响细胞健康的情况下调控pH值，成为优化丁醇生产的重要研究方向。

基因编辑技术，特别是CRISPR-Cas9系统，为梭菌的代谢工程提供了强有力的工具。通过敲除或过表达特定基因，研究者可以调控细胞内的代谢通路，从而影响丁醇的生成。例如，敲除磷酸丙酮酸变位酶（PTA）基因对梭菌ATCC 824的影响并不显著，而敲除乙酰辅酶A乙酰转移酶（AK）基因则能够减少乙酸的生成，同时提升丁醇和丙酮的产量。此外，敲除PTB基因会导致丁酸生成的完全抑制，并显著增加乳酸的产量。然而，当pH值被控制在5.0以上时，PTB基因的敲除反而会促进乙酸的重新吸收，并增加乙醇的生成，同时减少丁醇的产量。这表明，pH值的调控在基因编辑策略中起着至关重要的作用。

在溶剂生成阶段，基因敲除和过表达的组合对丁醇产量的影响尤为显著。例如，同时敲除PTB和BK基因，可以有效减少丁酸的生成，同时显著提高丁醇的产量。这种效果不仅体现在酸生成阶段，还延续到溶剂生成阶段，表明基因调控在代谢通路转换中的重要性。此外，通过过表达溶剂生成相关基因（如ctfA/B、aadC和adhE1），可以进一步提升丁醇的产量。然而，过表达adhE2基因并结合HK基因的敲除，才能实现丁醇浓度的显著提升，达到20克/升的水平。这表明，单一基因的调控可能不足以实现最佳效果，而需要综合考虑多个基因之间的相互作用。

梭菌的代谢调控不仅依赖于基因表达水平的变化，还受到细胞内还原力（reducing power）的影响。例如，敲除氢化酶基因（hydA）可以显著提高丁醇的产量和产率，这可能与细胞内NADH的供应有关。NADH是许多代谢反应的关键辅因子，其浓度可能限制丁醇的生成。因此，通过增加NADH的生成或减少其消耗，可以有效提升丁醇的产量。这一发现为代谢工程提供了新的思路，即通过调控NADH的平衡来优化丁醇生产。

在溶剂生成过程中，丁醇脱氢酶（BDH）的活性对丁醇的生成具有重要影响。例如，在DSM 792菌株中，通过CRISPR-Cas9工具对BDH基因进行编辑，发现单独敲除BDH基因对丁醇产量的影响较小，但同时敲除BDH A和B基因则显著降低了丁醇的生成，而三重敲除BDH A、B和C基因的影响更为剧烈。这表明，BDH基因在丁醇生成过程中扮演着关键角色，其调控策略可能对提高丁醇产量至关重要。

此外，基因过表达技术也被广泛应用于梭菌的代谢工程中。例如，在梭菌beijerinckii D9菌株中，过表达磷酸果糖激酶（pfkA）和丙酮酸激酶（pykA）基因能够显著提升丁醇的产量。同样，将溶剂生成相关基因（如ctfA/B、aadC和adhE1）整合到梭菌acetobutylicum的染色体中，可以延长产溶剂时间，提高丁醇的生产效率。这些研究结果表明，基因过表达不仅可以增强特定代谢通路的活性，还可能通过改变细胞内的代谢平衡来提升丁醇的产量。

在实际应用中，代谢模型的建立对于优化基因编辑策略具有重要意义。通过构建动态的代谢模型，研究者可以预测不同基因敲除和过表达组合对丁醇产量的影响，从而减少实验成本和时间。例如，本研究中提出的模型不仅能够准确描述梭菌ATCC 55025和ATCC 824菌株的代谢行为，还能够模拟基因敲除和过表达后的动态变化。该模型基于SpoA/SpoAP调控机制，将基因表达的变化与代谢通路的转换联系起来，为理解梭菌代谢调控提供了新的视角。

模型的构建和验证过程中，研究者利用了实验数据，并通过全局敏感性分析和非参数Bootstrap方法确定了模型参数的置信区间。这种数据驱动的建模方法能够确保模型的准确性和可靠性，为后续的代谢工程研究提供理论支持。同时，模型的稳定性也得到了验证，其对葡萄糖和丁醇浓度的预测具有较高的置信度，表明该模型在实际应用中具有较大的潜力。

在基因编辑策略的选择上，研究者发现不同的基因组合对丁醇产量的影响存在显著差异。例如，敲除HK基因并过表达溶剂生成相关基因，能够显著提升丁醇的产量，而单独敲除HK基因的效果则有限。这提示我们，基因调控的效果往往不是孤立的，而是依赖于多个基因之间的协同作用。因此，在设计代谢工程策略时，需要综合考虑基因之间的相互作用，以实现最佳的代谢优化效果。

此外，模型的建立也为未来的研究提供了方向。例如，通过进一步探索不同基因敲除和过表达组合对代谢通路的影响，可以更全面地理解梭菌的代谢调控机制。同时，结合其他调控因子（如NADH、SpoA等）的研究，可以为提高丁醇产量提供更深入的理论依据。在实际应用中，这些模型还可以用于指导反应器设计和分离工艺的优化，从而实现丁醇生产的工业化应用。

综上所述，生物丁醇的生产仍面临诸多挑战，但通过基因工程手段对梭菌代谢通路的调控，已经取得了一定的进展。研究者们发现，基因敲除和过表达的组合能够显著提升丁醇的产量，同时pH值的调控在代谢通路转换中起着重要作用。此外，模型的建立为理解这些调控机制提供了重要的工具，有助于指导未来的代谢工程研究和实际应用。随着研究的深入和技术的进步，生物丁醇的生产有望在未来的能源结构中占据更加重要的位置。