用于扩增电化学检测HPV DNA的酶联凝集素测定法

《Biosensors and Bioelectronics》：Enzyme-linked lectin assay for amplified electrochemical detection of HPV DNA

HPV DNA检测采用酶联凝集素电化学方法，通过PNA探针特异性捕获目标序列，经磷酸锆交联连接二糖链，利用lectin-ALP标记和银纳米颗粒沉积实现双重信号放大，检测限达0.24 fM，兼具高选择性和血清适用性，适用于点诊断场景。

　　人类乳头瘤病毒（HPV）是一类无包膜的双链DNA病毒，属于乳头瘤病毒科。这类病毒广泛存在于人类的皮肤和黏膜表面，尤其在性传播过程中具有重要影响。HPV感染通常会引起疣状病变，而某些高危型别如HPV16和HPV18则与癌症的发生密切相关。特别是HPV16，它被发现与口腔-咽喉癌、宫颈癌以及阴茎癌等多种癌症类型有显著关联。尽管目前尚无针对HPV感染的特异性治疗方法，但通过早期筛查和诊断，可以有效预防这些与HPV相关的癌症。因此，开发高灵敏度、高选择性的检测方法对于高危HPV感染的识别和癌症预防具有重要意义。

现有的HPV检测方法主要包括基于核酸扩增技术（NAA）的方法，如聚合酶链反应（PCR）、环介导等温扩增（LAMP）、转录介导扩增（TMA）和滚环扩增（RCA）。这些方法虽然在灵敏度方面表现出色，但通常需要复杂的实验设备、专业的技术人员以及较长的实验时间，限制了它们在偏远地区和资源有限环境中的应用。为了提高检测的便捷性和可及性，近年来，研究人员开发了多种基于生物传感器的检测方法，包括表面增强拉曼散射（SERS）、侧向流动测定（LFA）、电化学发光（ECL）、光电化学（PEC）和电化学检测方法。其中，电化学生物传感器因其设备紧凑、成本低廉、操作简便，成为高危HPV感染检测的热门研究方向。

在这些方法中，电化学生物传感器展现出一定的优势，但仍然存在一些挑战。例如，传统的电化学检测方法依赖于特定的酶标记或信号放大机制，如使用辣根过氧化物酶（HRP）催化底物的氧化反应，以提高检测灵敏度。然而，这类方法在实际应用中可能会受到背景信号干扰，导致检测灵敏度下降。因此，为了进一步提高检测性能，研究人员开始探索新的信号放大策略，以实现更高效的HPV DNA检测。

近年来，酶联凝集反应（ELLA）作为一种新型的检测方法，引起了广泛关注。ELLA最初由McCoy等人（1983）引入，作为酶联免疫吸附测定（ELISA）的一种变体。ELLA的基本原理是利用糖类和糖基化分子（如糖蛋白、细胞、细菌和病毒）与凝集素之间的特异性结合，通过酶催化反应实现信号放大。具体来说，ELLA方法包括以下几个步骤：首先，将糖类或糖基化分子预固定在微孔板上；然后，加入凝集素-酶偶联物，使其与糖类结合；最后，通过酶催化的底物转化产生可检测的信号。这种方法已被广泛应用于糖类-凝集素相互作用的研究、糖结构的分析、糖基化分子的检测以及糖苷酶抑制剂的筛选。

受到ELLA方法在糖类检测中的成功应用启发，研究人员尝试将其引入到HPV DNA的检测中。通过将ELLA与电化学技术相结合，开发了一种新的电化学检测方法，用于高危HPV感染的高灵敏度和高选择性检测。该方法的关键在于利用糖基化分子与凝集素之间的特异性结合，结合磷酸-Zr(IV)-羧酸（PZrC）交联技术，实现对HPV DNA的高效捕获和信号放大。具体而言，该方法使用肽核酸（PNA）探针作为HPV DNA的捕获探针，PNA探针具有较高的稳定性和选择性，能够有效区分单个碱基错配的DNA序列。在捕获目标序列后，利用PZrC交联技术将糖基化分子修饰到目标序列的磷酸位点，随后通过糖基化分子与凝集素之间的亲和力，招募碱性磷酸酶（ALP）作为标记物。最后，通过ALP催化反应，将无色底物转化为有色产物，从而实现对HPV DNA的高灵敏度检测。

在该方法中，PZrC交联技术起到了关键作用。这种交联方式能够使每个磷酸位点都被糖基化分子修饰，从而使得每个目标DNA序列可以被多个ALP标记。这种多重标记机制有效放大了电化学信号，提高了检测的灵敏度。实验结果显示，在HPV16特异性DNA序列作为目标的情况下，该方法的检测限达到了0.24 fM，表明其具有极高的灵敏度。此外，该方法在选择性方面也表现出色，能够有效区分单个碱基错配的DNA序列，确保检测结果的准确性。同时，该方法适用于血清样本中的HPV DNA检测，说明其具有良好的应用前景。

除了灵敏度和选择性，该方法在操作便捷性和时间效率方面也具有显著优势。与传统的核酸扩增技术相比，ELLA-based电化学方法不需要复杂的实验步骤或昂贵的设备，因此更易于在临床环境中推广。特别是在即时检测（point-of-care）场景中，该方法可以快速、准确地完成HPV DNA的检测，为临床医生提供及时的诊断信息。此外，该方法的检测时间较短，能够满足大规模筛查的需求，从而提高检测效率。

在实际应用中，该方法的稳定性和可重复性也是重要的考量因素。由于PNA探针具有较高的稳定性，能够在广泛的pH范围内保持活性，因此该方法在不同的实验条件下仍然能够保持较高的检测性能。同时，通过优化实验参数，如反应时间、温度和试剂浓度，可以进一步提高检测的准确性和可靠性。此外，该方法的检测过程可以模块化，便于在不同类型的检测设备上进行适配，从而扩大其应用范围。

总的来说，ELLA-based电化学方法为高危HPV感染的检测提供了一种新的思路。该方法结合了ELLA的高选择性和电化学技术的高灵敏度，实现了对HPV DNA的高效检测。同时，该方法在操作便捷性和时间效率方面表现出色，适用于多种样本类型，包括血清样本。因此，该方法在临床筛查和即时检测中具有重要的应用价值。未来，随着技术的不断进步和优化，ELLA-based电化学方法有望在更广泛的范围内得到应用，为HPV感染的早期诊断和癌症预防提供有力支持。