同时提取并整合细胞形态和细胞表面蛋白表达信息，以实现多模式单细胞分析

《Biosensors and Bioelectronics》：Simultaneously extracts and integrates cell morphology and cell surface protein expression for multimodal single-cell analysis

本研究提出基于机器学习的多模态耦合分析方法，整合细胞形态特征（如面积、周长、圆形度等）和表面蛋白特征（如MUC1、EGFR等），显著提升单细胞分类准确率至94.46%，并通过多模态耦合增强模型稳定性。

　　单细胞多模态分析是一种结合多种数据类型，如细胞形态特征、基因表达、蛋白质组学和代谢组学等，对单个细胞进行全面观察和研究的技术。这种方法能够从多个维度捕捉细胞之间的差异，从而深入理解细胞的异质性。然而，单细胞多模态数据的获取和处理过程相对复杂，存在诸如数据噪声、缺失值和批次效应等问题，这些因素限制了机器学习模型在单细胞异质性研究中的应用和发展。因此，提出一种集成的单细胞多模态耦合分析策略，能够同时提取和整合细胞形态特征与细胞表面蛋白特征，成为当前研究的重要方向。

在单细胞研究中，每种细胞都具有独特的特征。传统的整体分析方法往往只能提供平均的信息，忽略了细胞间的个体差异。相比之下，单细胞多模态分析能够在多个角度对单个细胞进行观察，并整合来自不同模态的数据，如细胞形态、基因表达、蛋白质组和代谢组等。这种方法不仅能够更全面地反映细胞的状态和功能，还为理解生命系统的多样性与复杂性提供了坚实的基础。近年来，随着多组学技术的不断发展，单细胞多模态分析的技术手段也日益丰富。例如，ISSAAC-seq技术能够同时分析单细胞的转录组和染色质可及性，为研究基因表达调控提供了有力工具；CITE-seq技术则结合了单细胞转录组学和蛋白质检测，实现了对单细胞中RNA和表面蛋白丰度的同时量化，从而建立了细胞表面蛋白与转录组信息之间的关联；patch-seq技术可以同时测量细胞的基因表达和细胞内电活动；ATAC-seq与基因表达联合分析技术则能够同时测量细胞的基因表达和DNA可及性；NEAT-seq技术可以分析转录组、染色质可及性和核蛋白丰度，有助于深入研究表观遗传调控对细胞的影响。

随着单细胞多模态分析技术的不断进步，数据整合与分析已成为研究中的关键挑战。由于不同模态的数据具有不同的特征和噪声水平，如何有效整合这些数据并提取有价值的信息，成为当前研究的重点。为此，各种基于深度学习的数据整合方法不断被开发，以提高整合效果和数据分析的准确性。例如，UnitedNet是一种具有可解释功能的多任务深度神经网络，能够整合不同任务来分析单细胞多模态数据，并应用于多种多模态数据集；MUSE是一种基于多模态数据整合的算法，能够通过整合形态学和空间解析的转录数据来表征细胞和组织区域；scBasset是一种基于序列的深度学习方法，能够用于分析单细胞ATAC-seq和多组学数据集，帮助识别调控细胞状态的转录因子。

然而，机器学习模型的性能高度依赖于数据的质量和预处理过程，而数据的获取和处理过程相对复杂，可能导致数据噪声、缺失值和批次效应等问题，进而影响模型的准确性和可靠性。此外，在单细胞多模态分析中，由于数据的高维性和样本数量相对较少，机器学习模型容易出现过拟合现象，这会降低模型的泛化能力和实际应用效果。因此，有必要开发一种新的策略，以克服这些技术障碍，提高单细胞多模态分析的可行性。

为了实现这一目标，我们提出了一种基于多层感知机（MLP）的单细胞多模态耦合分析策略，用于整合细胞形态特征和细胞表面蛋白特征。具体来说，我们利用荧光成像技术获取细胞表面蛋白的图像，从而准确识别和分割单个细胞。随后，我们从分割后的单细胞图像中提取形态学特征，并通过深度学习算法对这些特征进行训练、聚类和分类分析。通过这种方式，我们能够更有效地整合不同模态的数据，提高模型的准确性和稳定性。

在实验中，我们选择了七种细胞模型，包括3t3、4t1、A549、Ct26、HeLa、Hepa1-6和Raw。我们选择了六种细胞形态特征，包括面积、周长、圆度、圆形度、紧凑性和费雷特直径，作为细胞形态特征的输入。同时，我们识别了MUC1、EGFR、HER2和TLR4四种细胞表面蛋白特征。通过这些特征的整合，我们能够更全面地理解细胞的异质性，并提高模型的泛化能力。

在实验过程中，我们使用自动聚焦功能的自动化荧光显微镜获取宽场荧光图像，以确保图像质量。随后，我们对宽场荧光图像进行分割，生成100×100像素的单细胞图像。为了提取细胞形态特征，我们基于单细胞图像的明场层进行分析。此外，我们使用分子荧光标记技术获取细胞表面蛋白的图像，从而对单细胞中多种表面蛋白的丰度进行量化。

通过这些步骤，我们能够实现单细胞多模态特征的整合，并利用深度学习算法对这些特征进行训练和分析。实验结果表明，基于多模态特征的整合分析显著提高了单细胞分类的准确性，达到了94.46%的水平。此外，该方法还提高了分析的稳定性，使得模型在仅需10次训练后即可达到稳定状态，且波动范围远小于单细胞形态特征和单细胞表面蛋白特征的分析结果。这表明，我们的多模态耦合模型能够有效克服过拟合的风险，提高模型的泛化能力和实际应用效果。

在单细胞多模态分析中，除了技术手段的优化，实验材料的选择也至关重要。我们使用的癌细胞系包括3t3、4t1、A549、Ct26、HeLa、Hepa1-6和Raw。这些细胞系的选择基于其在细胞形态和表面蛋白表达方面的代表性，能够为多模态分析提供丰富的数据支持。此外，我们使用的分子适配体包括Ma3、R13、HeA2_3和ApTLRapt#4，这些适配体由Sangon Biotech（上海）有限公司提供，能够确保实验的可重复性和数据的准确性。

在细胞培养过程中，我们使用了多种试剂，包括DMEM高糖培养基、RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶（含EDTA）、磷酸盐缓冲液（PBS）和二甲基亚砜（DMSO）。这些试剂的选择和使用能够确保细胞在实验过程中的正常生长和健康状态。此外，我们还使用了10× PBS磷酸盐缓冲液、STE缓冲液和4%的其他试剂，以确保实验条件的稳定性和数据的可靠性。

为了验证我们提出的多模态耦合分析策略的有效性，我们进行了实验验证。实验结果表明，该策略能够显著提高单细胞分类的准确性，并且在模型训练过程中表现出较高的稳定性。这不仅证明了多模态数据整合在单细胞分析中的优势，也为未来研究提供了新的思路和方法。通过这种方式，我们能够更全面地理解细胞的异质性，并为生命科学研究提供更加精准的数据支持。

此外，我们还关注了实验过程中可能遇到的挑战和问题。例如，由于单细胞数据的高维性和样本数量相对较少，机器学习模型容易出现过拟合现象，这会影响模型的泛化能力和实际应用效果。因此，我们需要在实验设计中采取相应的措施，如增加样本数量、优化数据预处理流程和引入正则化技术，以提高模型的鲁棒性和泛化能力。同时，我们也注意到，虽然一些先进的多模态技术已经取得了显著进展，但它们的实用应用仍面临一定的障碍。例如，CITE-seq等基于测序的方法虽然能够同时分析RNA和表面蛋白，但需要昂贵的测序设备、复杂的文库制备流程和专业的生物信息学知识，这限制了其在常规研究中的应用。因此，有必要开发一种更加实用、成本低廉且易于实施的分析策略，以降低技术门槛，提高单细胞多模态分析的可及性。

综上所述，单细胞多模态分析作为一种综合性的研究方法，能够从多个角度对细胞进行观察和研究，为理解细胞的异质性提供了更加全面的数据支持。然而，该方法在数据获取和处理过程中仍面临诸多挑战，如数据噪声、缺失值和批次效应等问题，这些因素限制了机器学习模型在单细胞异质性研究中的应用和发展。因此，开发一种集成的多模态耦合分析策略，能够有效克服这些技术障碍，提高模型的准确性和稳定性，成为当前研究的重要方向。通过这种方式，我们不仅能够更深入地理解细胞的异质性，还能为生命科学研究提供更加精准的数据支持和分析工具。