通过网络毒理学和整合生物信息学分析，探讨二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯暴露对阿尔茨海默病的毒理学影响

《Brain Research Bulletin》：Exploring the toxicological impact of di(2-ethylhexyl) phthalate exposure on Alzheimer's disease via network toxicology and integrative bioinformatics analysis

本研究通过整合计算生物学方法，系统解析了环境污染物DEHP（邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯）通过破坏线粒体稳态和神经元结构完整性促进阿尔茨海默病发展的潜在机制，并识别了TUBB4B、KDM1A等核心生物标志物。方法包括网络毒理学、机器学习（LASSO、随机森林、SVM-RFE）和分子对接。结果揭示了DEHP与靶蛋白的强结合（如TUBB4B和PON2结合能低于-5 kcal/mol），并关联到氧化应激、炎症反应（如AGE-RAGE和MAPK通路激活）等病理过程。讨论指出需实验验证环境浓度下的毒性效应及多污染物协同作用。

　　阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种逐渐恶化的慢性神经系统疾病，严重影响人类健康，尤其是老年人群体。随着人口老龄化的加剧，AD的发病机制和预防策略已成为全球医学研究的重要课题。近年来，越来越多的研究开始关注环境因素在AD发病中的作用，其中，邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP）作为一种常见的塑料增塑剂，因其能够穿透血脑屏障并引发多种神经毒性效应而受到重视。本文通过整合计算生物学方法，包括网络毒理学、机器学习和分子对接技术，系统地探讨了DEHP在AD发生发展中的潜在机制，为环境风险评估和AD生物标志物的识别提供了理论基础。

DEHP是一种广泛存在于日常生活中的人工合成化合物，常见于塑料制品、化妆品、食品包装材料等。由于其化学性质稳定且成本低廉，DEHP被大量用于工业生产中。然而，其作为环境污染物的潜在危害也逐渐显现。DEHP不仅可以通过食物和空气进入人体，而且其分子结构使其具备良好的脂溶性，从而能够轻易穿过血脑屏障，进入中枢神经系统。一旦进入大脑，DEHP可能通过多种机制对神经细胞造成损害，包括诱导氧化应激、破坏线粒体功能、干扰神经元结构稳定性以及激活神经炎症反应。这些作用可能与AD的核心病理特征密切相关，如β-淀粉样蛋白沉积、神经纤维缠结等。

目前，关于DEHP与AD关系的研究仍存在诸多不足。一方面，现有研究多集中于单一的毒理效应，未能全面揭示DEHP对AD多靶点分子通路的影响；另一方面，研究方法也存在一定的局限性，如暴露剂量评估不够精确、缺乏对关键易感期的系统研究、缺乏长期随访数据以及对混杂因素的控制不足。因此，有必要采用更加系统和综合的方法，以更准确地解析DEHP对AD的潜在影响。本文通过构建多方法整合分析框架，结合网络毒理学、机器学习和分子对接等技术手段，从多个角度探讨了DEHP在AD中的作用机制，旨在弥补当前研究的空白。

在方法学方面，研究首先利用PubChem数据库获取DEHP的标准SMILES结构，并通过Swiss Target Prediction、STITCH和ChEMBL等数据库预测其可能的靶点蛋白。随后，从GeneCards和OMIM数据库中筛选出与AD相关的基因，通过Venn图分析确定了338个共同靶点基因。这些基因涉及多种关键的生物学过程，包括线粒体稳态调控、细胞膜电位调节、氧水平感知、蛋白磷酸化调控等。进一步的GO和KEGG通路富集分析表明，DEHP相关靶点可能在AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt级联反应、神经退行性变和MAPK信号通路中发挥重要作用。这些发现为理解DEHP如何通过多靶点机制影响AD提供了重要的线索。

为了更深入地解析DEHP对AD的潜在影响，研究还采用了转录组数据分析和加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）。研究者从GEO数据库中获取了两个与AD相关的转录组数据集（GSE5281和GSE28146），并对这些数据进行了批次效应校正，随后通过分层随机抽样将数据分为训练集和验证集。在训练集中，使用limma包进行了差异表达分析，筛选出具有显著差异表达的基因。WGCNA进一步分析了这些基因的共表达模式，识别出11个不同的基因模块，并从中筛选出与AD发生显著相关的模块。最终，通过整合差异表达基因和共同靶点基因，确定了7个核心基因：CAPN2、GRIN1、KDM1A、NOTCH2、PON2、TUBB4B和YAP1。其中，CAPN2、KDM1A、NOTCH2、PON2和TUBB4B被进一步筛选为DEHP与AD相关的核心靶点。

为了评估这些核心靶点在AD诊断中的潜在价值，研究还结合了多种机器学习算法，包括LASSO回归、随机森林（Random Forest, RF）和支持向量机递归特征消除（Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination, SVM-RFE）。这些算法通过交叉验证筛选出最可能的生物标志物，并进一步结合文献证据排除了与AD无关的基因。最终，确定了TUBB4B、CAPN2、NOTCH2和PON2为与AD密切相关的基因。通过对这些基因在训练集和验证集中的表达水平进行分析，发现它们在AD患者脑组织中表现出显著的表达差异。例如，TUBB4B和KDM1A在AD组织中的表达水平明显低于正常对照组，而其他三个基因的表达则显著升高。这些结果表明，这些基因可能在AD的早期诊断和疾病进展中具有重要作用。

此外，研究还进行了基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA），以进一步揭示这些核心靶点在AD病理过程中的功能。通过将基因表达数据按照中位数分为高表达和低表达两组，研究发现这些基因在多个关键生物学过程中表现出显著的富集，包括线粒体内膜蛋白复合物、氧化磷酸化、亨廷顿病、帕金森病以及蛋白酶体通路等。这些发现不仅强调了线粒体功能障碍在AD中的核心地位，还表明DEHP可能通过干扰这些关键通路，间接促进AD的病理进程。例如，线粒体功能障碍可能导致活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的过量生成，进而抑制蛋白磷酸酶2A（PP2A）的活性，激活GSK-3β，从而导致tau蛋白的异常磷酸化和β-淀粉样蛋白斑块的形成。

为了更全面地理解DEHP对AD的影响，研究还分析了核心靶点基因与免疫细胞浸润之间的关联。通过CIBERSORT算法，研究者评估了AD患者脑组织中22种免疫细胞类型的浸润水平，并发现AD组织中浆细胞和CD4+幼稚T细胞的比例显著降低。进一步的Spearman相关性分析表明，核心靶点基因的表达水平与某些免疫细胞的浸润程度存在显著关联。例如，CAPN2、NOTCH2和PON2的表达水平与CD4+幼稚T细胞的比例呈负相关，而PON2的表达水平与M1型巨噬细胞和激活的记忆型CD4+T细胞的比例呈正相关。这些结果提示，DEHP可能通过调节免疫细胞的组成和功能，间接影响AD的发病过程。

在分子对接分析方面，研究者使用AutoDock Vina对DEHP与四个核心靶点蛋白（TUBB4B、CAPN2、NOTCH2和PON2）之间的潜在结合关系进行了模拟。通过构建蛋白质结构并优化其构象，研究者评估了DEHP与这些靶点蛋白的结合能。结果表明，DEHP与这些蛋白的结合能均低于-5.0 kcal/mol，表明其具有一定的结合亲和力。其中，DEHP与TUBB4B和PON2的结合能分别为-7.3 kcal/mol和-7.9 kcal/mol，表明其与这些蛋白的结合尤为紧密。这一发现为理解DEHP如何通过直接作用于关键蛋白来影响AD提供了重要的分子基础。

然而，尽管计算生物学方法在解析DEHP与AD之间的复杂关系方面具有显著优势，但其研究结果仍需谨慎解读。分子对接模拟所得的高结合亲和力通常是在较高浓度下的预测结果，而现实环境中DEHP的暴露浓度远低于这一阈值。因此，这些结果可能无法直接应用于人类健康风险评估。此外，当前研究主要关注DEHP的单一暴露效应，而实际环境中，人类往往同时接触多种环境污染物，如其他邻苯二甲酸酯类化合物、双酚A和苯酮类化合物等。这些污染物可能通过共享的毒性通路产生协同或叠加效应，进一步加剧AD的病理过程。因此，未来的研究应关注混合暴露条件下的DEHP毒性效应，以更准确地评估其在AD发病中的实际作用。

综上所述，本文通过整合计算生物学方法，系统地揭示了DEHP在AD发生发展中的潜在作用机制。研究结果表明，DEHP可能通过破坏线粒体稳态、诱导氧化应激、激活神经炎症反应以及干扰关键神经蛋白的功能，间接促进AD的病理进程。尽管计算方法为解析DEHP的神经毒性提供了重要的理论依据，但其结论仍需通过实验验证。未来的研究应结合体外和体内实验，进一步验证这些核心靶点在AD中的具体作用机制，并评估DEHP在真实环境暴露条件下的毒性效应。此外，研究还应关注DEHP与其他环境污染物的交互作用，以更全面地理解其对AD的影响。通过这些研究，有望为制定更科学的环境风险评估标准和AD预防策略提供重要的参考依据。