基于骨髓的高度敏感蛋白质组学分析揭示了儿童B细胞急性淋巴细胞白血病的宝贵生物标志物

《Cancer Letters》：Bone marrow-based highly sensitive proteomics profiling reveals valuable biomarkers for pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia

儿童B-ALL诊断与预后分层研究采用Olink蛋白质组学分析骨髓血浆，发现37个差异蛋白（DEPs），经LASSO回归筛选出9个关键蛋白（CXCL13、NCR1、ADA、IL6、HO-1、CCL3、CCL4、CD27、ADGRG1），诊断AUC达0.98。通过ELISA和PDX模型IHC验证CCL3/CCL4/CD27表达升高，并与ETV6-RUNX1等预后相关基因关联。

　　近年来，儿童B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的研究取得了显著进展，特别是在分子分型和精准治疗方面。然而，传统的基因组学方法虽然在风险分层和临床管理中发挥了重要作用，但往往存在成本高、耗时长的问题。为了解决这一挑战，研究者们采用了一种新型的高灵敏度和高特异性技术——Olink蛋白质组学分析，以探索B-ALL患者与完全分子缓解（CMR）对照组在骨髓血浆中蛋白质表达的差异。通过两个独立的队列研究，研究人员发现了一系列关键的差异表达蛋白（DEPs），这些蛋白不仅具有良好的诊断价值，还可能与疾病进展和预后密切相关。

### 1. 儿童B-ALL的流行病学特征与临床意义

B-ALL是儿童中最常见的恶性肿瘤之一，占所有急性淋巴细胞白血病（ALL）病例的约85%。该病的发病高峰主要出现在1至4岁之间的儿童群体中，随后在5至14岁、青少年及年轻成人阶段明显下降。尽管在高收入国家，儿童B-ALL的五年总体生存率已超过90%，但在实际临床中，仍然有相当数量的患儿出现治疗抵抗，导致较差的预后结果。因此，早期诊断和准确的风险分层对于改善患儿的治疗效果至关重要。当前的治疗策略主要基于风险分层，通常结合临床特征（如年龄和白细胞计数）、细胞遗传学分析以及最小残留病（MRD）的评估。然而，传统的诊断手段往往难以全面反映疾病的分子机制，限制了对疾病生物学特征的深入理解。

### 2. Olink蛋白质组学技术的优势与应用

Olink蛋白质组学技术基于高灵敏度的邻近扩增分析（Proximity Extension Assay, PEA）方法，能够在极小的样本体积下同时检测大量蛋白质标志物。这一特性使得Olink技术特别适用于儿童B-ALL这类样本获取受限的疾病研究。研究中，Olink Target 96 Oncology Response蛋白面板被用于检测骨髓血浆样本中的92种与肿瘤反应相关的蛋白质。通过标准化的log2尺度表达值分析，研究人员发现37种DEPs在B-ALL患者与CMR对照组之间存在显著差异。这些差异蛋白不仅包括细胞功能调控分子，还涵盖了趋化因子受体活性、白细胞粘附和细胞因子介导的信号传导等免疫相关过程。

### 3. 差异表达蛋白的筛选与验证

为了进一步筛选出具有诊断价值的蛋白标志物，研究团队采用LASSO回归模型，从37种DEPs中挑选出9种蛋白，包括CXCL13、NCR1、ADA、IL6、HO-1、CCL3、CCL4、CD27和ADGRG1。这些蛋白在两个独立的队列（发现队列和验证队列）中均表现出良好的区分能力，其中发现队列的AUC值为1.0，验证队列的AUC值为0.98，表明其具有极高的诊断准确度。为了确保这些蛋白的可靠性，研究者们还通过酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫组织化学（IHC）方法进行了独立验证。结果显示，CCL3、CCL4和CD27等蛋白在B-ALL患者的骨髓血浆中表达显著升高，与Olink分析结果一致。此外，IL-6、TNF和ADGRG1的表达也显示出升高的趋势，而NCR1、ADA、HO-1、IL12RB1、CXCL13、PD1和CD5则未见显著差异。这些结果不仅验证了Olink分析的准确性，还提供了更深入的分子机制理解。

### 4. 蛋白质功能富集与蛋白-蛋白相互作用分析

为了进一步揭示这些DEPs在B-ALL发生发展中的作用，研究团队进行了基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和原核生物同源群（COG）的功能富集分析。结果显示，这些DEPs主要富集在与免疫调控、炎症反应和细胞信号传导相关的生物学过程中。例如，CCL3和CCL4作为趋化因子，可能在骨髓微环境中促进白血病前体细胞的募集和存活。此外，CD27和ADGRG1的上调可能反映了细胞存活和粘附信号的紊乱，这些信号在白血病维持中起着关键作用。功能富集分析还揭示了这些蛋白在细胞因子受体结合和T细胞激活正向调节中的重要性，这与B-ALL的免疫微环境密切相关。

### 5. 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析

通过构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，研究者们发现这些DEPs之间存在复杂的相互作用关系。其中，CCL3与CCL4之间的正向相关性最强，表明它们可能在相同的生物学通路中发挥作用。此外，GZMA和GZMB也表现出显著的正向相关性，这提示它们可能共同参与细胞毒性反应。PPI网络的构建不仅有助于理解这些蛋白在B-ALL中的协同作用，还为后续的功能研究提供了重要线索。网络中的节点和边的权重反映了蛋白之间的相互作用强度，进一步支持了这些蛋白在疾病进展中的核心地位。

### 6. 蛋白质亚细胞定位分析

研究团队还对这些DEPs的亚细胞定位进行了预测分析。结果显示，大多数DEPs主要定位于细胞外空间，这与它们在细胞间通讯和免疫调控中的作用相一致。此外，部分蛋白与细胞膜相关，如ADGRG1、TNF、FASLG和CD5，这些蛋白可能在细胞膜信号传导中发挥重要作用。少数蛋白则定位于细胞核、细胞质和过氧化物酶体，这提示它们可能参与细胞内的信号传导或代谢调控。亚细胞定位的分析结果进一步支持了这些蛋白在B-ALL病理生理过程中的多样性功能。

### 7. 预后价值与临床意义

研究还发现，某些DEPs在具有不良预后基因改变的B-ALL患者中表达显著升高，如Ph-like特征、CRLF2重排和MLL-AF易位等。这些基因改变通常与较高的复发率和较差的治疗反应相关。相比之下，具有良好预后特征的患者，如ETV6-RUNX1融合，表现出较低的DEPs水平。这一结果表明，DEPs可能作为预后标志物，用于进一步的风险分层和治疗策略的制定。例如，TNF、CCL3、IL12RB1、PDCD1和GZMB的上调可能反映了免疫系统的异常激活和炎症反应的增强，这些因素可能与白血病的进展和治疗抵抗有关。

### 8. 潜在的治疗靶点

基于这些DEPs的生物学功能和临床意义，研究团队探讨了它们在治疗中的潜在应用。例如，IL6的升高可能与JAK/STAT3信号通路的激活有关，这一通路在白血病细胞的存活和增殖中起着重要作用。通过阻断这一通路，可能有助于提高治疗效果。此外，CD27和ADGRG1的上调可能提示细胞存活和粘附信号的异常，这为开发针对这些信号通路的靶向治疗提供了新的思路。NCR1的改变可能反映了先天免疫监视的异常，而ADA的失调可能与白血病细胞的代谢重编程有关。这些发现不仅加深了对B-ALL分子机制的理解，也为未来的治疗策略提供了新的方向。

### 9. 研究的局限性与未来展望

尽管本研究在B-ALL的诊断和预后评估方面取得了重要进展，但仍存在一些局限性。首先，研究样本量相对较小，尤其是在不同基因改变的患者中，样本的多样性可能影响结果的普遍性。其次，虽然Olink技术在样本利用效率和检测速度方面具有显著优势，但其在其他类型的血液恶性肿瘤和炎症性疾病中的应用仍需进一步验证。此外，这些DEPs的临床价值仍需在更大规模的患者群体中进行评估，以确保其在实际临床中的适用性和可靠性。

综上所述，本研究通过Olink蛋白质组学技术，揭示了儿童B-ALL与CMR对照组之间的关键蛋白差异，并验证了这些蛋白在诊断和预后评估中的重要性。这些发现不仅为B-ALL的分子机制提供了新的见解，也为未来的精准治疗策略提供了潜在的靶点。未来的研究应进一步扩大样本量，探索这些蛋白在不同疾病状态下的特异性，并结合其他临床和分子标志物，以实现更全面的疾病管理。