跨越时空的“基因身份证”：全球大肠杆菌ST10复合体中发现高度保守的CRISPR间隔序列组

《ISME Communications》：Discovery of an identical CRISPR spacerome in a subset of global E. coli strains spanning decades

本研究针对当前难以精细追踪大肠杆菌( E. coli )传播路径的难题，研究人员开展了CRISPR间隔序列组(spacerome)分析。他们意外发现，属于ST10复合体（特别是ST167）的临床大肠杆菌菌株，尽管分离自25个国家、时间跨度近20年且存在单核苷酸多态性(SNP)差异，却共享完全相同的CRISPR间隔序列组。该结果表明CRISPR spacerome可作为传统分型方法（如SNP、ST）的补充工具，为高分辨率追踪高关注耐药菌株（如产碳青霉烯酶大肠杆菌CPE）的传播提供了新思路。

　　

在微生物的世界里，细菌与病毒（噬菌体）之间永无休止的“军备竞赛”催生了一套精妙的免疫系统——CRISPR-Cas（成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白）。这套系统如同细菌的“免疫记忆库”，通过将入侵过的病毒或质粒DNA片段（称为原型间隔序列protospacer）整合到自身的CRISPR阵列中，形成由重复序列和间隔序列（spacer）交替组成的“基因档案”。这些间隔序列的集合被称为“间隔序列组”（spacerome），理论上可以记录细菌种群遭遇外源遗传物质的历史，从而为追溯细菌的传播和进化路径提供独特线索。

大肠杆菌作为广泛存在于环境、动物和人体中的重要细菌，其某些耐药克隆，如属于ST10克隆复合体（Clonal Complex）的ST167型，因常携带碳青霉烯酶基因（如bla_NDM, bla_KPC, bla_OXA）而成为全球公共卫生的重大威胁。传统的菌株分型方法，如基于全基因组的单核苷酸多态性（SNP）分析和多位点序列分型（MLST），虽广泛应用，但在区分高度相近的菌株或追踪长期、跨地域传播时可能存在局限。因此，开发新的、更高分辨率的分子标记工具对于精准流行病学调查至关重要。本研究旨在探索利用CRISPR spacerome分析作为补充工具，来追踪大肠杆菌，特别是耐药克隆的传播动态。

本研究综合利用了培养组学、分子生物学和生物信息学方法。首先，研究人员从美国爱荷华州的环境（地表水）、动物（猪、牛粪便）和临床（患者）来源分离了大肠杆菌。对于环境和动物来源的菌株，通过特异性PCR扩增并测序分析了其CRISPR I-E和I-F型基因座。对于临床来源的产碳青霉烯酶大肠杆菌（CPE）菌株，则进行了全基因组测序（WGS）以获取完整的基因组信息，包括CRISPR阵列。利用CRISPRFinder工具鉴定CRISPR阵列，并通过CRISPRTarget工具预测间隔序列的起源（原型间隔序列）。构建了间隔序列库进行比对分析。此外，为了评估研究发现在全球范围内的普适性，研究团队对美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中超过30万个大肠杆菌基因组进行了大规模筛选，寻找与在爱荷华州临床菌株中发现的特定CRISPR spacerome（阵列A）完全相同的序列，并对筛选出的代表性菌株进行了详细的基因组分析（如核心基因组SNP系统发育分析）。

分布CRISPR系统、间隔序列和重复序列在环境、动物和人类患者中的分布

研究共分析了188株大肠杆菌（环境112株，动物57株，人类患者19株）。CRISPR基因座在临床分离株中携带率最高（100%），环境和动物分离株中分别为50%和38.6%。I-E型是主要的CRISPR类型。在所有菌株中共鉴定出582个独特的间隔序列，其中大部分（75%）的原型间隔序列来源未知，被称为“暗物质”；已识别的原型间隔序列主要来源于原噬菌体（19.6%）和肠杆菌科质粒（5.5%）。环境菌株的间隔序列多样性高于临床菌株，推测与环境中毒性噬菌体丰度高、选择压力大有关。

临床大肠杆菌的Spacerome与SNP、系统发育群和ST谱分析

对19株临床CPE菌株的分析发现，其中9株菌共享两种不同的但内部完全一致的CRISPR spacerome（分别命名为阵列A和阵列B）。尤为重要的是，携带相同spacerome（阵列A）的7株菌（如IA0003, IA0009, IA0012, IA0018等）均属于ST167和系统发育群A，尽管它们分离自2018至2023年的不同患者，且携带的碳青霉烯酶基因不同（如KPC-3, NDM-5, OXA-48）。SNP分析显示这些菌株之间存在不同程度的遗传差异（从7个到4720个SNP不等）。例如，菌株IA0003和IA0008分离自同一患者在2018年和2020年的样本，仅相差7个SNP，均携带bla_KPC。而菌株IA0012与其他携带阵列A的菌株SNP差异巨大（最少2604个），却拥有完全相同的spacerome。这表明，尽管基因组背景存在变异（可能由于宿主肠道内应激或基因突变导致），其CRISPR spacerome却保持了惊人的稳定性。研究人员推测，这些菌株可能源于同一个祖先克隆，在传播过程中通过质粒交换获得了不同的碳青霉烯酶基因，而CRISPR阵列本身则相对稳定地遗传下来。

环境和动物来源大肠杆菌的Spacerome分析

与环境菌株相比，临床菌株的spacerome显示出更高的同质性。环境菌株中未发现完全相同的spacerome，但部分菌株共享一些靠近leader序列的、较小的、部分相同的间隔序列阵列，这些菌株通常属于相同的系统发育群（如B1, D）。这种差异可能与环境中强烈的噬菌体选择压力导致间隔序列频繁更替和重排有关。

对检索到的全球大肠杆菌分离株的CRISPR阵列表征

为了验证这一发现在全球范围内的意义，研究人员通过BLASTn搜索，从NCBI数据库的30多万个大肠杆菌基因组中，鉴定出266个携带与爱奥华州临床菌株完全相同的CRISPR spacerome（阵列A）的菌株。对其中76个具有完整元数据的菌株进行深入分析，并根据其CRISPR阵列的微小变异（如个别间隔序列的插入/缺失或核苷酸重复）划分出不同的亚型（如SA, SA1, SA2等）。

具有相同Spacerome的大肠杆菌分离株的全球分布

核心基因组SNP系统发育分析显示，携带主要spacerome类型（SA型，n=40）的菌株，绝大多数（37/40）来源于人类，属于ST167，并且通常携带碳青霉烯酶基因（NDM-5, KPC-3, OXA-1）。这些菌株广泛分布于美国、中国、瑞士、坦桑尼亚等全球至少25个国家，分离时间从2006年持续到2023年，跨度近20年。与此相对，从环境、动物或食品中分离的、携带SA变异亚型的菌株，在系统发育树上则形成了不同的分支。

本研究首次系统地比较分析了来自环境、动物和临床样本的大肠杆菌CRISPR spacerome。研究最关键的发现是，在全球传播的ST10克隆复合体（特别是ST167）大肠杆菌中，存在一个高度保守、跨越时空（25个国家，近20年）而保持不变的CRISPR spacerome。这种稳定性与以往认为CRISPR间隔序列是动态更新的观点不同，推测可能与人类肠道环境中以溶原性噬菌体为主，细菌无需频繁更新其CRISPR“记忆”有关。研究表明，CRISPR spacerome分析可以作为一种新型的、高分辨率的分子分型工具，与SNP、ST等传统方法互补，用于精细追踪特定耐药克隆（如CPE）的传播路线。这对于监测和防控像ST167这样具有多重耐药性和全球传播能力的“高风险克隆”具有重要意义。

该研究为细菌分子流行病学提供了新的视角和工具。尽管仍需更大规模、更长时间跨度的研究来验证spacerome的稳定性及其在传播动力学中的作用，但本研究无疑证明了利用CRISPR spacerome进行“菌株指纹”识别的巨大潜力。未来，建立全球性的CRISPR spacerome数据库，将极大地促进对重要病原菌传播链的精准识别和有效干预。本研究发表于《ISME Communications》。