小鼠整个腓肠肌及分离出的肌纤维对急性耐力运动诱导的信号蛋白磷酸化及丰度变化的差异性反应

《Current Research in Physiology》：Differential responses to acute endurance exercise-induced signaling protein phosphorylation and abundance alterations in whole murine gastrocnemius muscle and isolated myofibers

本研究通过比较全身肌肉和分离肌纤维样本，发现急性耐力运动后全身肌肉的AMPK/ACC/p38信号通路和葡萄糖代谢相关蛋白显著激活，而分离肌纤维中这些响应不明显，但自噬相关蛋白在两者中均增加。

　　本研究旨在探讨急性耐力运动对骨骼肌中信号蛋白磷酸化和表达水平的影响，特别是通过从整块肌肉组织或分离的肌纤维中提取蛋白质样本进行分析。骨骼肌作为人体最大的器官，占体重的约40%（Frontera and Ochala, 2015），具有高度的可塑性、多样性和异质性（Cai et al., 2023；Martínez Mir et al., 2024；Brook et al., 2016）。近年来，随着单细胞RNA测序技术的发展，人们开始尝试从单细胞水平理解骨骼肌的复杂异质性，包括内皮细胞、成肌细胞前体、成纤维细胞、免疫细胞和脂肪细胞等。此外，即使是同一块骨骼肌，靠近肌腹的中心部分与靠近近端或远端肌腱的区域在代谢表型（如肌纤维类型比例）上也存在差异（Martínez Mir et al., 2024），这表明要全面分析骨骼肌在生理反应和适应方面的多样性和异质性，仅依赖整块肌肉组织的分析可能不够充分。

运动是维持和改善骨骼肌质量和功能的有效手段，对于健康和积极的生活方式至关重要（Abou Sawan et al., 2023；Zhou et al., 2025）。已有大量研究表明，不同类型的短暂运动能够激活和改变多种与生理反应相关的信号蛋白，包括葡萄糖摄取、糖酵解、线粒体生物合成和含量支持的氧化代谢，以及肌肉蛋白质的合成与分解（Little et al., 2011；Kido et al., 2016；West et al., 2016）。然而，大多数这些研究结果均来自整块骨骼肌组织的分析，而对运动诱导的信号反应在肌纤维层面的研究仍显不足。因此，本研究的目标是同时分析从整块肌肉组织和分离肌纤维样本中提取的蛋白质的磷酸化和表达水平变化，以评估可能的肌纤维特异性运动诱导信号反应。

为了达到这一目标，研究采用了一种实验方法，即通过在含有0.2%胶原酶的培养基中孵育来分离肌纤维。这种方法常用于初级卫星细胞培养（Ono et al., 2012），并被证明在小鼠骨骼肌中能有效提高卫星细胞的线粒体呼吸功能（Shirai et al., 2025）。然而，之前的一些研究也显示，通过冻干肌肉获得的分离肌纤维样本中信号蛋白的磷酸化和表达水平存在变化（Campos et al., 2025；Horwath et al., 2025；Deshmukh et al., 2021）。尽管如此，关于分离肌纤维与整块肌肉组织在运动诱导信号反应方面的差异仍然不明确。因此，本研究试图通过比较两种样本类型，揭示运动对骨骼肌信号蛋白的影响是否具有肌纤维特异性。

研究对象为12只8周龄的雄性Institute of Cancer Research小鼠，由Oriental Yeast Co. Ltd.（东京，日本）提供。小鼠被安置在恒定温度（22°C±2°C）和湿度（55%±5%）的实验设施中，遵循12小时光照/黑暗循环，并自由获取食物和水。经过一周的适应期后，小鼠被随机分为静息对照组和运动组（每组6只）。所有实验程序均获得了东京大学茨木校区机构动物实验委员会的批准（动物伦理批准号：23–380），并基于美国国立卫生研究院关于实验动物护理与使用的指南（National Research Council Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 2011）。所有实验均遵循《实验生理学》中关于动物实验报告的准则（Grundy, 2015）。

在运动实验中，小鼠被放置在平底跑步机上，以25 m/min的速度进行60分钟的跑步训练。运动后立即对小鼠进行麻醉并用颈椎脱位法处死，随后取其腓肠肌样本，进行蛋白质提取。对于整块肌肉组织，使用含有50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid（pH 7.6）、150 mM氯化钠、10 mM乙二胺四乙酸、10 mM焦磷酸钠、10 mM氟化钠、2 mM正钒酸钠、1%（v/v）非离子去污剂P-40、1%（v/v）钠脱氧胆酸、0.2%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）和1%（v/v）完整的蛋白酶抑制剂混合物的匀浆液提取蛋白质。匀浆样品在4°C下以15,000×g的速度离心20分钟，收集上清液。

对于分离的肌纤维样本，右腿的腓肠肌被置于含有0.2%胶原酶（Worthington）的高葡萄糖Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）中，在37°C下孵育90分钟，每15分钟轻轻搅拌。孵育后，将肌纤维转移到含有DMEM的培养皿中，并使用宽口Pasteur吸管进行五次分离。分离后的肌纤维被收集，去除多余的DMEM，然后加入与整块肌肉组织提取相同的匀浆液提取蛋白质。匀浆样品同样在4°C下以15,000×g的速度离心20分钟，收集上清液。

蛋白质的Western blot分析采用了蛋白浓度测定试剂盒（BCA试剂盒，FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.，大阪，日本）。在进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）之前，提取的蛋白溶液与等体积的样品加载缓冲液混合，该缓冲液含有1%（v/v）2-巯基乙醇、4%（w/v）SDS、125 mM Tris-HCl（pH 6.8）、10%（w/v）蔗糖和0.01%（w/v）溴酚蓝。混合后，在95°C下煮沸5分钟，将5 μg蛋白加载到凝胶上，分离后转移到Immuno-Blot PVDF膜（Bio-Rad Laboratories）上。膜在室温下使用5%脱脂乳在TBS（含0.1% Tween-20）中阻断1小时，随后在ImmunoShot Platinum（Cosmo Bio Co., LTD.）中与一抗孵育过夜。洗涤后，膜与辣根过氧化物酶标记的二抗（#7074或#7076，Cell Signaling Technology）在室温下孵育60分钟。信号通过Immobilon Forte Western HRP底物（WBLUF0500，Millipore）进行可视化，并使用FUSION化学发光成像系统（M&S Instruments，大阪，日本）进行检测。信号强度通过Image J软件（美国国家卫生研究院，马里兰州巴尔的摩市）进行量化，并以静息对照组的平均值为基准表达为任意单位。Ponceau S染色用于验证蛋白加载的一致性。

研究中使用的初级抗体包括：1:1000抗磷酸化AMPK（Thr172，#2535）、1:1000抗AMPK（#2793）、1:1000抗磷酸化ACC（Ser79，#11818）、1:1000抗ACC（#3676）、1:1000抗磷酸化p38MAPK（Thr180/Tyr182，#4511）、1:1000抗p38MAPK（#8690）、1:1000抗PGC-1α（516557）、1:1000抗OPA1（612606）、1:1000抗OXPHOS（ab110413）、1:1000抗柠檬酸合成酶（CS，ab96600）、1:1000抗VDAC1/Porin（ab15895）、1:1000抗MFN1（ab126575）、1:1000抗MFN2（ab124773）、1:1000抗DRP1（ab56788）、1:1000抗GLUT4（ab33786）、1:1000抗MuRF1（ab172479）、1:1000抗Fbx32（ab168372），这些抗体均购自Cell Signaling Technology。此外，1:1000抗PFK1（sc-377346）购自SantaCruz Biotechnology，1:1000抗p62/SQSTM1（PM045）和1:1000抗Parkin（M230-3）购自Medical & Biological Laboratories。

统计分析采用非配对、双尾Student's t检验，所有统计分析均使用GraphPad Prism 10（GraphPad, Inc.）完成。统计显著性设为p < 0.05。

研究结果显示，急性耐力运动在整块肌肉组织中显著激活了与线粒体生物合成和蛋白合成相关的信号蛋白，包括AMPK、ACC、p38MAPK以及Akt/p70 S6激酶等。此外，运动还增加了与葡萄糖代谢相关的蛋白水平，如Hexokinase 1和Hexokinase 2。然而，这些信号反应并未在分离的肌纤维样本中观察到。相反，分离的肌纤维样本中与线粒体氧化磷酸化相关的蛋白水平显著下降，这表明运动诱导的信号反应在肌纤维和整块肌肉组织之间存在差异。因此，研究结果表明，运动诱导的信号蛋白激活和表达变化在整块肌肉组织和分离肌纤维样本中可能并不一致。

研究指出，在使用胶原酶解离的肌纤维评估运动诱导的生理反应时，需要谨慎考虑。事实上，预期的运动诱导的蛋白磷酸化变化并未在分离的肌纤维样本中出现。最近的一项研究表明，胶原酶处理会破坏细胞外基质，从而导致肌纤维结构、功能和细胞信号的严重急性变化（Gineste et al., 2022）。在胶原酶介导的分离过程中，肌纤维可能保持完整（可能具有活性）约2小时，这段时间内可能发生重要的蛋白激活和表达变化。相比之下，整块肌肉组织的蛋白质提取是在肌肉摘除后立即进行的。因此，胶原酶解离的肌纤维可能不是理想的模型，但在当前情况下，它可能是一个良好的替代方案，用于区分运动诱导的整块肌肉与分离肌纤维的变化。

在整块肌肉组织中，AMPK/ACC/p38信号通路以及AMPK/TBC1D4信号通路被激活，这些通路分别刺激线粒体生物合成和葡萄糖摄取。然而，在分离的肌纤维样本中，这些信号通路的激活被抑制。在骨骼肌中，AMPK的激活通常通过β-肾上腺素能受体激活，与激素分泌（如肾上腺素和去甲肾上腺素）以及由细胞因子（如白细胞介素-6）介导的肌肉间旁分泌作用相关（Wang et al., 2021；Ahsan et al., 2022）。另一方面，分离的肌纤维可能由于缺乏细胞外肌肉细胞环境和外部因素的影响，导致AMPK和ACC的激活被抑制。此外，在骨骼肌组织中，AMPK不仅在肌肉细胞中表达，还可能在非肌肉细胞（如内皮细胞、卫星细胞和免疫细胞）中表达，并可能受到炎症或缺氧的调节（Lyons and Roche, 2018；Sakushima et al., 2020）。因此，整块肌肉组织中的AMPK激活可能部分来源于非肌肉细胞类型。由于分离的肌纤维样本中去除了非肌肉成分，AMPK的激活可能并未被观察到。相比之下，Wang等人报告称，在游泳类型的耐力运动后，分离的肌纤维中AMPK、ACC和TBC1D4的激活显著增强（Wang et al., 2019）。这表明，运动时长和模式（如跑步、游泳和骑行）可能影响研究结果。

在整块肌肉组织中，我们未观察到OXPHOS蛋白水平的变化，而分离的肌纤维样本中多个OXPHOS亚基的表达水平显著下降。Martin等人报告称，通过高分辨率呼吸测定评估的线粒体呼吸功能在耐力运动后显著降低（Martins et al., 2018），这与我们的数据一致。因此，耐力运动后线粒体功能的下降可能部分由OXPHOS亚基表达水平的降低引起。线粒体自噬（mitophagy）可以选择性地清除功能异常的线粒体（Seabright and Lai, 2020）。然而，在本研究中，运动后分离的肌纤维样本中Parkin的表达并未增加，且柠檬酸合成酶（CS）和VDAC1的蛋白水平保持不变。因此，分离的肌纤维样本中OXPHOS亚基的减少可能与同时增加的泛素化蛋白水平有关。尽管如此，线粒体含量本身可能在运动后得以维持。

在调节线粒体动力学的因子中，DRP1（一种线粒体分裂调节因子和线粒体自噬诱导因子）的Ser616磷酸化水平在整块肌肉组织中显著增加，但在分离的肌纤维样本中却减少。尽管如此，分离肌纤维中DRP1磷酸化水平的下降的生理意义仍不明确。然而，我们的数据表明，耐力运动后DRP1 Ser616磷酸化水平的增加可能发生在非肌肉细胞类型中。

我们仅在整块肌肉组织中检测到Akt/mTOR和MAPK通路相关的信号蛋白激活，这些通路参与肌肉蛋白合成。多项研究表明，急性耐力运动在人类和啮齿类动物的整块肌肉组织中显著增加了Akt、mTOR、p70S6K和ERK1/2的磷酸化水平（Hayasaka et al., 2014；Pasiakos et al., 2010；Mascher et al., 2011），支持了本研究的结果。胰岛素、胰岛素样生长因子-1和其他生长因子被广泛认为能强烈激活Akt/mTOR信号（Liu and Sabatini, 2020）。此外，运动诱导的因子（如白细胞介素-6、白细胞介素-15和白血病抑制因子）由肌肉和其他器官释放，能够激活mTOR通路（Gao et al., 2017；Cornish et al., 2020），强调了运动后骨骼肌反应中器官间信号交流的重要性。此外，最近的研究表明，肌肉与非肌肉纤维之间的细胞间通信对于肌肉生长至关重要（Zhang et al., 2024；Sakai et al., 2024）。在本研究中使用的分离肌纤维样本中，来自血管或整块肌肉组织中的非肌肉细胞的血清因子影响被消除，这表明系统性运动诱导的蛋白合成反应可能不仅由肌肉细胞单独支持，还受到不同器官或细胞之间复杂信号交流的影响。

有趣的是，与其它信号通路不同，蛋白分解信号（特别是自噬相关的信号）在整块肌肉和分离肌纤维样本中均显著增加，这与之前的一项啮齿类研究结果一致（Vainshtein et al., 2015）。然而，由于LC3B比率（自噬泡形成指标）仅在整块肌肉样本中显著增加，自噬激活可能主要发生在整块肌肉组织的水平上。相比之下，分离肌纤维样本中LC3B比率的变化并不显著。此外，之前的一些人类研究显示，运动后整块骨骼肌或肌纤维中的LC3B-Ⅱ表达被抑制（Horwath et al., 2025；Mazo et al., 2021；Schwalm et al., 2015），这提示实际的自噬流应谨慎解读。我们之前的研究发现，使用跑步机进行耐力运动训练能够显著增加小鼠整块肌肉组织中的泛素化蛋白水平，而不会改变MuRF1和Fbx32蛋白的表达（Shirai et al., 2021）。因此，运动后泛素化蛋白水平的增加并不一定伴随泛素连接酶表达的增加，可能由未知机制介导，如增强肌纤维的泛素化过程。

研究的局限性在于，我们仅分析了蛋白质的丰度和磷酸化水平，而未能评估mRNA表达的变化。事实上，在运动后数小时，mRNA表达的变化往往比蛋白质含量的变化更为显著（Egan and Zierath, 2013）。因此，为了更全面地理解信号反应，需要将蛋白质和mRNA表达进行整合分析。此外，我们无法排除分离过程本身可能带来的代谢、机械和环境应激（如胶原酶处理期间的温度变化、分离过程中的机械应力以及氧气供应的变化）对肌纤维样本中信号蛋白的影响。因此，未来的研究需要在相同条件下标准化整块肌肉组织和分离肌纤维样本的蛋白质提取过程，以确保结果的一致性。在此背景下，一些研究使用从冻干整块肌肉组织中分离的肌纤维来检测肌纤维特异性的运动反应（Horwath et al., 2025；Deshmukh et al., 2021；Wang et al., 2019；Kristensen et al., 2015）。尽管冻干可能使肌纤维信号反应的检测更为严格，但两种方法应直接比较。此外，本研究中未能检测或去除死亡的肌纤维，仅通过目视检查尽可能收集漂浮的肌纤维。因此，合并肌纤维的数量未被量化。最后，本研究仅分析了腓肠肌，因此可能掩盖了肌纤维类型特异性的运动反应。未来的研究应比较腓肠肌的红色和白色部分，或慢肌纤维（氧化型）和快肌纤维（糖酵解型）在急性运动后的反应，以进一步探索运动对不同类型肌纤维的影响。