评估用4种不同递送载体包裹的传染性造血坏死（IHN）口服DNA疫苗对虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）中IHN病毒感染的保护作用

《Fish & Shellfish Immunology》：Evaluation of protective effect of infectious hematopoietic necrosis (IHN) oral DNA vaccine wrapped with 4 different delivery vectors against IHN virus (IHNV) infection in rainbow trout ( Oncorhynchus mykiss)

IHN DNA疫苗结合不同递送载体（PLGA、CS、SA、MONTANIDE? GR01）喂食虹鳟鱼幼鱼，通过腹腔注射IHNV验证免疫保护效果。结果显示MONTANIDE? GR01组病毒增殖抑制最显著，并诱发早期免疫应答，相对存活率最高。本研究初步筛选出适合IHN口服疫苗的递送载体。

　　

邵一志|赵京庄|李婷|刘伟通|卢同燕|徐黎明

中国水产科学院黑龙江渔业研究所水生动物疾病与控制系，黑龙江省水生动物疾病与免疫技术重点实验室，哈尔滨，150070，中国

摘要

传染性造血坏死（IHN）是一种由传染性造血坏死病毒（IHNV）引起的具有高致病性和高死亡率的病毒性疾病，对养殖鲑科鱼类造成了严重影响。此前，研究团队已经开发出了注射用IHN灭活疫苗和DNA疫苗，这些疫苗具有良好的保护效果和较长的保护期。在本研究中，将IHN DNA疫苗包裹在聚（乳酸-羟基乙酸）（PLGA，75:25）、壳聚糖（CS）、海藻酸钠（SA）和MONTANIDE? GR01中，然后喂给虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）鱼苗（10 ± 2 g），随后进行腹腔注射攻击实验（1000TCID₅₀，每条鱼100 μL），以探讨四种不同递送载体DNA疫苗对IHNV感染的保护效果。结果表明，与CS、SA和PLGA相比，MONTANIDE? GR01作为IHN DNA疫苗的递送载体更为合适。此外，将高剂量IHN DNA疫苗与MONTANIDE? GR01混合后喂给虹鳟鱼鱼苗，可以有效抑制IHNV病毒的增殖，诱导机体的早期免疫反应并提高相对存活率。本研究初步筛选出了一种适用于虹鳟鱼的IHN DNA口服疫苗递送载体，为后续口服疫苗的开发提供了基础。

引言

传染性造血坏死（IHN）是一种对鲑鱼和鳟鱼具有高度致命性的病毒性疾病，主要发生在幼鱼阶段，死亡率可达100%。由于其爆发迅速且致死率高，IHN给国内外鲑鱼和鳟鱼养殖业造成了严重的经济损失[1,2]。世界动物卫生组织（WOAH）将IHN列为进出口贸易中必须申报的动物疫病，中国农业农村部也将其列为II类动物疫病[3,4]。

疫苗是控制疾病发生的主要手段。为了有效控制IHN的爆发，许多国家开展了IHN疫苗的研发工作，包括灭活疫苗、减毒疫苗和DNA疫苗[5,6]。加拿大和挪威已成功将IHN DNA疫苗应用于鲑鱼和鳟鱼养殖，并有效控制了该疾病的爆发[7]。目前，中国正在致力于水生疫苗的市场化和产业化，研究团队开发出了保护率超过90%的IHN DNA疫苗[8]。作为DNA疫苗，IHN DNA疫苗需要通过肌肉注射进行免疫，这不利于其大规模推广。

Duff等人（1942年）成功开发了一种针对气单胞菌的口服灭活疫苗，开启了水生动物疾病口服疫苗预防和控制的先河。然而，与人类和动物用口服疫苗的研究相比，鱼类用口服疫苗的研发进展相对较慢。20世纪末，研究人员尝试开发能够将疫苗输送到肠道后段的递送载体，以增强免疫保护[9]。其中，海藻酸钠、壳聚糖（CS）和聚（乳酸-羟基乙酸）（PLGA，75:25）常被用作疫苗递送载体[10,11]。目前已报道的鱼类用口服疫苗包括淋巴囊肿病毒海藻酸钠口服疫苗[12]、微囊化IHNV口服疫苗[13]、海藻酸钠嗜水气单胞菌口服疫苗[14]、海藻酸钠气单胞菌杀鲑菌口服疫苗等[15]。此外，SEPPIC公司开发的MONTANIDE? GR01被认为适用于鱼类口服疫苗接种，并已在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）口服疫苗中得到验证[16]。

在本研究中，将IHN DNA疫苗包裹在四种不同的递送载体（PLGA、CS、海藻酸钠（SA）和MONTANIDE? GR01）中，然后喂给虹鳟鱼鱼苗，并通过腹腔注射IHNV来测试四种不同口服疫苗的保护效果。首先进行了实验室规模实验，评估了接种后的早期免疫反应和保护情况。本研究为鱼类口服疫苗的应用提供了研究基础。

部分内容摘要

细胞、病毒培养和虹鳟鱼

本研究使用了IHNV菌株Sn1203（GenBank编号：DQ164100）。使用上皮瘤乳头状细胞（EPC）细胞系（ATCC CRL-2872）进行体外 IHNV研究，该细胞系在25°C、0.5% CO₂气氛下培养于M199基础培养基（M199，GIBCO，中国），添加10%胎牛血清（FBS，Gibco BRL，美国纽约州格兰德岛）和100单位/mL的青霉素和链霉素。EPC细胞以0.1的MOI接种IHNV，在含有2% FBS的M199培养基中于15°C条件下进行扩增[17]

四种递送佐剂的安全性分析

在本研究中，分别将四种选定的递送佐剂喂给虹鳟鱼。所有组的虹鳟鱼均正常进食，未出现不良反应。HE染色结果显示，与对照组相比，CS高剂量组和GR 01高剂量组的肝脏、脾脏、头肾和心脏的HE染色无病理变化；PLGA高剂量组的脾脏出现淋巴细胞增生；SA高剂量组的肝脏观察到炎症细胞（图1）。

四种不同递送佐剂疫苗对IHNV的保护效果

四种递送

讨论

口服疫苗具有操作简便、劳动成本低且对鱼类伤害小的优点，因此是水产养殖中最流行的接种方法。因此，迫切需要开发用于控制养殖鱼类疾病的口服疫苗[25]。然而，由于口服疫苗容易被胃肠道中的胃酸和消化酶降解，其研发仍面临一些挑战。安全高效的递送系统是实现这一目标的基础

结论

本研究将IHN DNA疫苗包裹在四种不同的递送载体（PLGA、CS、SA和MONTANIDE? GR01）中，然后喂给虹鳟鱼鱼苗，以研究IHN口服DNA疫苗对IHNV的免疫保护效果。结果表明，与CS、SA和PLGA相比，MONTANIDE? GR01作为IHN DNA疫苗的递送载体更为合适。将高剂量IHN DNA疫苗与MONTANIDE? GR01混合后喂给虹鳟鱼鱼苗，可以有效抑制IHNV病毒的增殖，诱导机体的免疫反应

作者贡献声明

邵一志：方法学、数据管理、撰写及审稿编辑。赵京庄：研究调查、数据管理。李婷：研究调查、方法学、资源协调。刘伟通：方法学、资源协调。卢同燕：项目管理、监督。徐黎明：资金获取、撰写及审稿编辑。

资金信息

本研究得到了中央公益性科学研究机构基础研究基金（中国水产科学院）[HSY202307Q, 2024XT0504, 2025XT0103, 2023TD45]以及黑龙江省重点研发计划（[2024ZXDXB38, JD24A013）的资助。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。