暴露在口腔环境中的唾液中的多菌群动态：整合细菌和真菌的相对及绝对丰度信息

《Forensic Science International: Genetics》：Multi-kingdom microbiota dynamics in exposed saliva: Integrating relative and absolute abundance across bacteria and fungi

该研究通过90天双环境（恒温箱与室内）暴露实验，结合16S rRNA和ITS绝对定量测序技术，系统解析了唾液细菌和真菌群落的时空动态变化。结果显示核心细菌属（如链球菌属、放线菌属等）保持稳定，但绝对细菌丰度随时间显著下降；真菌丰度在25天后逐渐上升并成为优势菌群，与细菌丰度呈负相关。相对丰度更适用于个体识别，而绝对丰度结合真菌数据能显著提升时间估算模型精度（MAE=7.485天，R2=0.905）。

　　本研究探讨了唾液在不同环境暴露条件下微生物群落的结构和数量变化。唾液作为人体的重要体液之一，蕴含着丰富的微生物群落，这些微生物不仅在个体识别中发挥关键作用，还在体液来源鉴定、地理信息推断以及时间自沉积估计（Time Since Deposition, TsD）等方面具有重要意义。然而，目前关于唾液微生物群落随时间推移如何变化的研究仍存在诸多不足。大多数现有研究主要关注微生物群落的相对丰度和结构，未能充分揭示微生物数量的动态变化，同时忽略了真菌这一重要的微生物组成部分。因此，本研究采用了一种纵向追踪设计，结合了16S rRNA基因和ITS绝对定量测序技术，以全面分析唾液暴露过程中细菌和真菌群落的结构和数量变化。

实验中，研究人员在两种环境条件下进行了为期90天的暴露实验：一种是受控的培养箱环境，另一种是自然的室内环境。通过对不同时间点的唾液样本进行分析，研究者观察到了微生物群落的动态演变过程。在细菌方面，尽管经历了长时间的暴露，某些核心菌属如链球菌（Streptococcus）、放线菌（Actinomyces）、棒状杆菌（Rothia）、淋病奈瑟菌（Neisseria）、溶血丙酸杆菌（Veillonella）和普雷沃特菌（Prevotella）依然在唾液样本中保持较高存在率。这表明，即使在外部环境的影响下，唾液中仍有一些稳定的微生物群落。此外，研究还发现唾液微生物群落与环境微生物之间存在相互作用，这种相互作用随着时间的推移而增强，表明外部环境对唾液微生物的影响是持续且累积的。

在真菌方面，研究发现新鲜唾液中几乎检测不到真菌，但经过25天的培养箱暴露后，真菌开始出现，并且其数量随着时间的推移而逐渐增加，主要由曲霉菌（Aspergillus）主导。这一现象表明，唾液在暴露过程中为真菌提供了适宜的生长条件，尤其是在温暖和潮湿的环境中。真菌的出现不仅可能改变唾液的局部微环境，还可能通过竞争营养或与其他微生物之间的相互作用影响细菌群落的演变。然而，目前关于真菌在唾液暴露过程中的动态变化及其与细菌之间的关系仍缺乏系统研究，因此需要进一步探索。

本研究通过结合相对丰度和绝对丰度分析，揭示了唾液微生物群落的多维度变化。相对丰度分析表明，唾液微生物群落的结构具有一定的个体特异性，且在长期暴露后仍表现出中等程度的稳定性。然而，这种相对丰度的分析方法可能无法准确反映微生物数量的变化趋势。相比之下，绝对丰度分析能够更清晰地展示微生物数量随时间的变化，发现唾液中的总细菌数量在暴露过程中显著下降，而真菌数量则持续上升。这种细菌和真菌数量之间的负相关关系提示了微生物群落之间可能存在某种动态平衡，或者外部环境对两者的影响方向不同。

值得注意的是，相对丰度在个体识别方面表现出更高的有效性，而绝对丰度则在估算时间自沉积方面更具优势。这一发现对于建立基于微生物群落的个体识别和时间自沉积预测模型具有重要意义。此外，研究结果还表明，将真菌数据纳入分析可以显著提高时间自沉积预测模型的准确性。通过使用绝对定量方法，研究团队构建了一个具有较高预测能力的模型，其平均绝对误差（Mean Absolute Error, MAE）为7.485天，决定系数（R2）达到0.905。这一结果表明，多界微生物分析在提升模型预测能力方面具有显著优势。

在方法上，本研究采用了多种先进的技术手段，包括16S rRNA基因测序和ITS绝对定量测序。16S rRNA基因测序用于分析细菌群落的结构，而ITS测序则用于研究真菌的组成。同时，研究还引入了参考物加入法（spike-in method），这种方法可以与下一代测序技术相结合，从而实现对微生物绝对数量的精确估计。通过在样本中加入已知拷贝数的合成DNA序列，并利用其对应的测序读数建立标准曲线，研究者能够更准确地计算出每个样本中微生物的绝对丰度。这种方法为长期暴露样本的微生物数量分析提供了新的思路，弥补了传统相对丰度分析在揭示微生物数量变化方面的不足。

实验设计方面，本研究严格遵循伦理规范，并得到了南方医科大学生物医学伦理委员会的批准。研究共招募了8名健康志愿者（4名女性，4名男性），他们在至少两个月内未使用任何与口腔疾病相关的药物，包括抗生素，以确保样本的一致性。所有参与者均在了解研究目的和性质的前提下签署了书面知情同意书。实验过程中，研究人员收集了唾液样本和对照样本，共计341份，其中包括240份暴露唾液样本（来自8名参与者，在两种暴露条件下共采集15个时间点的样本），以及90份阴性对照、8份阳性对照和3份空白对照。所有样本均进行了16S rRNA基因V3–V4区域扩增子测序，以分析细菌群落的组成。然而，由于三种空白对照样本的测序失败，它们被排除在后续分析之外。

在结果分析中，研究团队发现唾液微生物群落的结构和数量变化呈现出复杂的模式。一方面，核心细菌菌属在长时间暴露后仍然保持较高的存在率，这可能与这些菌属的生态适应性有关。另一方面，暴露过程中微生物群落的相对丰度和绝对丰度呈现出不同的变化趋势。相对丰度的变化趋势显示了微生物群落的个体特异性，而绝对丰度的变化则更直接地反映了微生物数量的动态变化。这种差异表明，单独使用相对丰度或绝对丰度分析都可能无法全面揭示微生物群落的演变规律，因此需要将两者结合，以获得更准确的结论。

此外，研究还发现唾液微生物群落的结构和数量变化受到环境因素的显著影响。在培养箱环境中，微生物群落的变化更为剧烈，而室内环境则表现出一定的稳定性。这种差异可能与两种环境的温度、湿度、空气流通等因素有关。例如，培养箱环境通常具有较高的温度和湿度，这为微生物的生长提供了更为有利的条件，从而导致微生物数量的快速增加。相比之下，室内环境的条件更为复杂，可能受到更多外界因素的干扰，使得微生物群落的变化趋势更为微妙。

本研究的结果对于法医学和生物痕迹分析领域具有重要的应用价值。在实际案件中，唾液通常以干燥痕迹的形式出现，其微生物群落可能会经历较长时间的暴露，从而影响其在个体识别和时间自沉积估计中的可靠性。因此，了解唾液微生物群落在暴露过程中的动态变化，不仅有助于提高个体识别的准确性，还能为时间自沉积的预测提供更为可靠的依据。此外，研究还发现，真菌在唾液暴露过程中表现出显著的生长趋势，这提示在法医学分析中，真菌可能成为一种新的时间自沉积指标。

总体而言，本研究通过系统分析唾液在不同环境暴露条件下的微生物群落变化，揭示了微生物群落的动态演变规律。研究结果表明，结合相对丰度和绝对丰度分析能够更全面地理解微生物群落的结构和数量变化，同时，引入真菌数据可以显著提升时间自沉积预测模型的准确性。这些发现不仅丰富了唾液微生物群落研究的理论基础，也为法医学和生物痕迹分析提供了新的方法和技术支持。未来的研究可以进一步探索不同环境条件下微生物群落的变化机制，以及如何利用这些变化特征来优化个体识别和时间自沉积估计的模型。