策略性截短技术提高了重组布法罗纤维蛋白-5（FBLN5）在大肠杆菌中的表达效率

《Protein Expression and Purification》：Strategic Truncation improves Recombinant Expression of Buffalo Fibulin-5 (FBLN5) in Escherichia coli

本研究针对水牛纤维连蛋白-5（FBLN5）的早期妊娠诊断潜力，通过优化重组表达条件，成功表达并纯化截短FBLN5。采用pET-32a(+)表达系统和BL21CodonPlus(DE3)-RIL及Lemo21(DE3)宿主，经温度、诱导剂浓度等条件优化，发现截短FBLN5在18℃下表达效果最佳，并通过SDS-PAGE和Western blot验证其纯度及分子量（约36kDa），为后续开发诊断工具提供基础。

　　在当今快速发展的世界中，奶牛和水牛作为乳制品行业的重要支柱，为许多农民提供了主要的生计来源。它们在全球牛奶生产中发挥着重要作用，年产量接近9.3亿吨[1]。因此，提高奶牛的生命周期生产效率和实现高水平的繁殖效率成为满足日益增长需求的关键。特别是在奶牛和水牛等牲畜物种中，这一目标显得尤为重要。然而，尽管它们具有重要的经济价值，却面临着诸多繁殖挑战，包括较长的产犊间隔、延长的干奶期、延迟的青春期、重复繁殖、隐性发情以及高发的无发情现象。这些挑战在缺乏高效早期妊娠检测工具的情况下变得更加复杂[2, 3]。目前，可靠的早期妊娠检测工具的缺乏仍然是提升奶牛和水牛繁殖管理的主要障碍。隐性发情往往导致错误诊断，非妊娠的动物可能因缺乏发情行为而被误认为怀孕，从而错失繁殖机会，并可能导致不恰当的使用激素协议，如前列腺素F2α（PGF2α），该激素如果在妊娠动物身上使用，可能会引发流产。因此，提高繁殖和生产效率的关键策略之一是实现早期和准确的妊娠诊断，这有助于缩短产犊间隔并增加动物在其生命周期内产生的后代数量[4]。

当前，已有多种妊娠诊断方法被广泛应用，包括直接触诊、超声波检测和基于孕酮的检测。然而，这些技术存在固有的局限性，如设备成本高、需要专业人员操作，以及在灵敏度、准确性方面的问题，甚至存在假阴性结果的风险[5]。基于妊娠相关糖蛋白（PAGs）的检测方法已被探索用于早期妊娠检测。然而，PAG检测通常只能在妊娠的第30天后检测到，并且其在产后持续存在的特性可能影响检测的可靠性[6]。因此，迫切需要发现那些在概念植入后具有短期残留存在，并且在表达水平上呈现特定变化的分子标志物，以作为可靠的早期妊娠检测指标。

纤维蛋白-5（FBLN5），也被称为DANCE、EVEC或UP50，是一种分泌型糖蛋白，分子量约为65 kDa，其在细胞外基质（ECM）组织和组织稳态中发挥着关键作用。FBLN5在弹性纤维生物合成、血管发育和组织重塑中具有重要作用。其多功能性源于与多种ECM蛋白的相互作用，包括纤连蛋白-1、细胞外超氧化物歧化酶、潜伏的TGF-β结合蛋白2和3，以及赖氨酸氧化酶样蛋白-1。通过这些相互作用，FBLN5有助于微纤维支架的形成、弹性蛋白生成、信号调节、弹性蛋白前体沉积以及细胞与基质的交流。FBLN5的表达具有组织特异性和发展阶段依赖性。在成人人类中，它主要在结肠、心脏和卵巢中表达，而在发育中的小鼠中，它则在间质组织、母体内皮细胞、心包、神经嵴来源的结构和心内膜垫中被检测到。在受损伤的鼠动脉中，FBLN5的表达增加，进一步突显了其在血管重塑中的作用。在早期妊娠期间，FBLN5水平在蜕膜细胞中升高，表明其在滋养层侵入和胎盘发育中的调节作用。同样，在发育中的水牛卵巢中，其表达水平较高，与表面上皮和白膜的形成相关，提示其在性腺分化中的作用。在发育中的鼠肺中，FBLN5的表达在胚胎第18天到出生后第17天达到高峰，其中定位在间质细胞和肺血管中，显示出其在肺形态发生中的重要作用。

近年来，随着蛋白质组学技术的进步，已经促成了对水牛早期妊娠检测的新生物标志物的识别。Verma等人（2023）报告称，在水牛早期妊娠期间，纤维蛋白-5（FBLN5）以及其它纤维蛋白家族蛋白在尿液中显著上调。通过串联质谱标签（TMT）定量蛋白质组学和多重反应监测（MRM）以及酶联免疫吸附测定（ELISA）的验证，该研究展示了纤维蛋白-5作为非侵入性和可靠的早期妊娠检测生物标志物的潜力[16]。截至目前，尚无利用纤维蛋白-5作为水牛早期妊娠检测生物标志物的诊断工具被开发出来。

尽管纤维蛋白-5在生物学上具有重要意义，但在异源系统如大肠杆菌中实现其全长形式的重组表达仍然具有挑战性，这可能是由于其复杂的结构和翻译后修饰需求[17]。本研究的目标是优化纤维蛋白-5的重组表达和纯化，以便进一步将其用于水牛早期妊娠的诊断。我们从水牛（Bubalus bubalis）中获得了全长（约1290 bp）和截短（约494 bp）的FBLN5基因片段，并通过序列特异性引物结合NcoI和XhoI限制性位点成功扩增了这些片段。扩增后的产物通过琼脂糖凝胶电泳进行验证，并被克隆入带有C端硫氧还蛋白（Trx）溶溶性标签和N端6X His标签用于纯化的pET-32a(+)表达载体中。重组质粒通过CaCl?方法转化进入大肠杆菌Top10细胞中。通过热休克转化方法，将基因导入化学感受态细胞，并在18°C和37°C条件下进行表达优化。研究结果表明，尽管优化了多种表达条件，如温度、诱导、培养时间以及添加物，但未能检测到全长FBLN5的表达。因此，我们根据预测的抗原区域设计了一个截短版本的FBLN5，以克服在细菌宿主中表达全长FBLN5的困难。截短的FBLN5（带有Trx标签和6×His标签）在BL21CodonPlus (DE3)-RIL和Lemo21(DE3)宿主中，在18°C条件下，通过1 mM IPTG诱导，成功表达。此外，我们还成功纯化了可溶性截短的FBLN5，并通过增强化学发光（ECL）的Western blotting方法确认了其分子量（约36 kDa）和身份。

本研究的主要目标是进行FBLN5的分子克隆、表达和纯化，以开发其作为水牛早期妊娠检测的新型生物标志物。尽管在奶牛等物种中，早期和可靠的妊娠诊断具有重要性，但目前尚无任何分子工具能够提供足够的灵敏度、特异性和在受孕后前三周内的早期检测能力。在本研究中，我们同时探讨了全长和截短的FBLN5的表达情况，以评估其在水牛妊娠检测中的应用潜力。通过优化表达条件，我们发现截短版本的FBLN5能够有效表达和纯化，而全长FBLN5的表达则受到限制。这表明，截短形式的FBLN5可能更适合用于构建诊断工具，因为它不仅在细菌宿主中更容易表达，而且其抗原性也得到了增强，从而能够更有效地用于免疫检测。

FBLN5作为一种细胞外基质糖蛋白，其在弹性纤维组装、组织重塑和细胞粘附中具有重要作用。在哺乳动物的生殖系统中，尤其是在早期妊娠期间，子宫和胎盘组织会经历大量的重塑，这涉及基质蛋白和信号通路的相互作用。虽然FBLN5在血管和结缔组织生物学中的功能已被广泛研究[35]，但其在反刍动物繁殖中的表达特征和作为生物标志物的潜力仍需进一步探索。因此，本研究不仅为FBLN5的重组表达和纯化提供了重要的实验基础，也为未来在水牛早期妊娠检测中的应用奠定了坚实的基础。通过构建可溶性截短的FBLN5蛋白，我们希望能够进一步研究其在免疫检测中的应用，并最终开发出一种高效、准确、低成本的妊娠诊断工具，以提高奶牛和水牛的繁殖效率和生产性能。

此外，本研究还探讨了多种实验材料和设备的使用情况，以确保实验的顺利进行。pET-32a(+)质粒和大肠杆菌菌株TOP10、Lemo21(DE3)、BL21(DE3)以及BL21-CodonPlus(DE3)-RIL被用于克隆和表达。限制性酶（NcoI、XhoI）、T4 DNA连接酶和Platinum SuperFi II DNA聚合酶用于构建载体。DNA纯化和质粒提取试剂盒分别来自FAVORGEN（台湾）和Macherey-Nagel（德国）。BugBuster Master Mix（Novagen，美国）和ECL底物也被用于实验过程中，以确保蛋白的高效纯化和检测。

在分子克隆和表达方面，我们成功克隆了全长和截短的FBLN5基因片段，并通过CaCl?方法转化进入大肠杆菌Top10细胞中。通过热休克转化方法，将基因导入化学感受态细胞，并在18°C和37°C条件下进行表达优化。实验结果表明，尽管优化了多种表达条件，如温度、诱导、培养时间以及添加物，但未能检测到全长FBLN5的表达。因此，我们根据预测的抗原区域设计了一个截短版本的FBLN5，以克服在细菌宿主中表达全长FBLN5的困难。截短的FBLN5（带有Trx标签和6×His标签）在BL21CodonPlus (DE3)-RIL和Lemo21(DE3)宿主中，在18°C条件下，通过1 mM IPTG诱导，成功表达。此外，我们还成功纯化了可溶性截短的FBLN5，并通过增强化学发光（ECL）的Western blotting方法确认了其分子量（约36 kDa）和身份。

通过本研究，我们不仅揭示了FBLN5在水牛早期妊娠检测中的潜在应用，还展示了其在分子克隆和表达中的可行性。尽管全长FBLN5的表达在异源系统中面临挑战，但通过设计截短版本，我们成功实现了其重组表达和纯化。这为未来在水牛早期妊娠检测中的免疫学研究提供了重要的实验基础。此外，我们还发现，截短的FBLN5在细菌宿主中具有更高的表达效率，这可能与其结构简化和抗原性增强有关。因此，截短版本的FBLN5可能更适合用于构建诊断工具，因为它不仅在细菌宿主中更容易表达，而且其抗原性也得到了增强，从而能够更有效地用于免疫检测。

在研究过程中，我们还探讨了多种实验条件对FBLN5表达的影响。通过优化温度、诱导、培养时间以及添加物，我们发现这些条件对全长FBLN5的表达具有一定的影响，但未能实现其有效表达。因此，我们选择了截短版本的FBLN5进行进一步研究。这一结果表明，截短形式的FBLN5可能更适合用于构建诊断工具，因为它不仅在细菌宿主中更容易表达，而且其抗原性也得到了增强，从而能够更有效地用于免疫检测。

此外，我们还发现，截短的FBLN5在细菌宿主中具有更高的表达效率，这可能与其结构简化和抗原性增强有关。因此，截短版本的FBLN5可能更适合用于构建诊断工具，因为它不仅在细菌宿主中更容易表达，而且其抗原性也得到了增强，从而能够更有效地用于免疫检测。通过本研究，我们希望能够进一步研究其在免疫检测中的应用，并最终开发出一种高效、准确、低成本的妊娠诊断工具，以提高奶牛和水牛的繁殖效率和生产性能。

本研究还强调了FBLN5在细胞外基质组织和组织稳态中的重要作用。在哺乳动物的生殖系统中，尤其是在早期妊娠期间，子宫和胎盘组织会经历大量的重塑，这涉及基质蛋白和信号通路的相互作用。虽然FBLN5在血管和结缔组织生物学中的功能已被广泛研究[35]，但其在反刍动物繁殖中的表达特征和作为生物标志物的潜力仍需进一步探索。因此，本研究不仅为FBLN5的重组表达和纯化提供了重要的实验基础，也为未来在水牛早期妊娠检测中的应用奠定了坚实的基础。通过构建可溶性截短的FBLN5蛋白，我们希望能够进一步研究其在免疫检测中的应用，并最终开发出一种高效、准确、低成本的妊娠诊断工具，以提高奶牛和水牛的繁殖效率和生产性能。

通过本研究，我们还希望能够进一步研究FBLN5在免疫检测中的应用，并最终开发出一种高效、准确、低成本的妊娠诊断工具，以提高奶牛和水牛的繁殖效率和生产性能。此外，我们还发现，截短的FBLN5在细菌宿主中具有更高的表达效率，这可能与其结构简化和抗原性增强有关。因此，截短版本的FBLN5可能更适合用于构建诊断工具，因为它不仅在细菌宿主中更容易表达，而且其抗原性也得到了增强，从而能够更有效地用于免疫检测。

总之，本研究通过优化FBLN5的重组表达和纯化，揭示了其在水牛早期妊娠检测中的潜在应用。尽管全长FBLN5的表达在异源系统中面临挑战，但通过设计截短版本，我们成功实现了其重组表达和纯化。这一结果不仅为FBLN5的免疫学研究提供了重要的实验基础，也为未来在水牛早期妊娠检测中的应用奠定了坚实的基础。通过构建可溶性截短的FBLN5蛋白，我们希望能够进一步研究其在免疫检测中的应用，并最终开发出一种高效、准确、低成本的妊娠诊断工具，以提高奶牛和水牛的繁殖效率和生产性能。