《Protein Expression and Purification》：L-arginine interferes with functional studies of amyloid proteins
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研究测试L-精氨酸对易聚集蛋白（如α-synuclein和FUS）纯化的影响，发现添加L-精氨酸使蛋白纯化产量提升3-4倍，但抑制纤维化形成，表明其对纤维化研究不适用。
H.P. Chethana|U. Rathan Kumar|Gunimala Chakraborty|Arshdeep Sidhu
印度曼加洛尔Deralakatte的Nitte大学科学教育与研究中心分子遗传学与癌症系，邮编575018
摘要
内在无序蛋白/区域在癌症信号通路和神经退行性疾病（如帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病等）中非常普遍。由于这些蛋白具有粘性，纯化它们颇具挑战性。对于内在无序的淀粉样蛋白，体外聚集研究是研究其从液态到固态转变的理想方法。然而，在大肠杆菌中过度表达这些蛋白通常会导致不溶性蛋白的产生，这些蛋白在裂解和离心后会以包涵体的形式存在于细胞沉淀物中。向纯化缓冲液中添加L-精氨酸可以提高蛋白的溶解度。对于大多数结构明确的蛋白，提高溶解度可以增加功能性蛋白的产量。然而，对于与神经退行性疾病相关的易聚集蛋白（如α-突触核蛋白（帕金森病）、Aβ（阿尔茨海默病）、融合蛋白（肌萎缩侧索硬化症）等），添加L-精氨酸可能会干扰聚集过程。为了验证这一假设，我们在有无L-精氨酸的情况下纯化了易聚集的α-突触核蛋白和融合蛋白，并研究了它们的纤维化过程。虽然重组FUS蛋白较难制备，但α-突触核蛋白的纯化方法已经较为成熟；但在所有实验方案中，仍有大量蛋白以不溶性形式存在于沉淀物中。添加L-精氨酸后，这两种蛋白的纯化产量提高了约3倍，但纯化后的蛋白并未形成纤维，这表明在L-精氨酸存在下，淀粉样蛋白（α-突触核蛋白和融合蛋白）的溶解度增加并不适合用于聚集研究。
引言
由于内在无序蛋白的粘性特性，其在体外实验中的过表达和纯化过程较为困难[1,2]。蛋白质的无序状态会暴露出疏水残基，这些残基会促进蛋白质之间的自聚集以及与其它疏水表面的相互作用[3]。当宿主细胞被裂解后，大约50-80%的蛋白质会自聚集并形成不溶性沉淀[4,5]。剩余的可溶性蛋白也很难被纯化为高纯度，因为它们会继续粘附在纯化过程中使用的容器和基质表面[3]。为了提高蛋白的溶解度，通常会在缓冲液中添加各种添加剂。常见的添加剂包括去污剂（如NP-40、Triton X-100、SDS）、变性剂（如尿素、盐酸胍）或带电氨基酸（如L-精氨酸和L-谷氨酰胺）[6],[7],[8],[9],[10],[11]。虽然这些添加剂与蛋白质之间的具体分子作用机制尚不清楚，但它们被认为可以增加蛋白质的溶解度，从而将其从不溶性沉淀物中转移到可溶性溶液中[12]。然而，使用基于去污剂的添加剂存在蛋白质不可逆变性的风险[13]。纯化后的蛋白质后续的复性过程也可能具有挑战性。对于无序蛋白而言，由于缺乏稳定的三维结构，复性的需求较低，但它们与其他蛋白质的功能性相互作用仍可能受到影响。因此，在纯化过程中如果使用了去污剂，需要将其清除以获得功能性蛋白。
氨基酸添加剂（如L-精氨酸和L-谷氨酰胺）可以在不使蛋白质变性的情况下提高其溶解度和稳定性[7,14]。L-精氨酸的这种效应被称为“精氨酸效应”。其具体机制尚不清楚，一些研究表明L-精氨酸会与蛋白质的侧链和主链相互作用，改变蛋白质与溶剂的相互作用，从而减少蛋白质的聚集[14],[15],[16]。在缓冲液中加入0.1-2 M的L-精氨酸即可观察到这种效应，说明L-精氨酸与蛋白质和/或溶剂的相互作用较弱[16]。额外的L-精氨酸不会干扰后续的蛋白质-蛋白质或蛋白质-RNA相互作用，因此可以在最终储存缓冲液中保留[17]。L-精氨酸效应可使蛋白质纯化产量提高多达9倍[7]。这种由于溶解度提高而带来的产量增加，对于需要高浓度蛋白质的生物技术和结构研究非常有利。然而，目前尚未有关于L-精氨酸用于淀粉样蛋白纯化的研究报道。
像Aβ、α-突触核蛋白（αSyn）和融合蛋白（FUS）这样的淀粉样蛋白由于其低溶解度和高聚集倾向，纯化起来非常困难[18],[19],[20]。然而，在体外聚集实验中（为了理解聚集机制和筛选淀粉样蛋白抑制剂），这些蛋白需要形成纤维。因此，了解L-精氨酸是否能够提高这些蛋白的纯化产量非常重要。在本研究中，我们探讨了使用L-精氨酸纯化这些蛋白的效果。我们分别使用FUS和αSyn作为模型蛋白，这两种蛋白分别与肌萎缩侧索硬化症和帕金森病相关。我们在有无L-精氨酸的情况下采用相同的纯化方案对它们进行了处理，并比较了它们的聚集特性。
材料与方法
本研究使用了两种蛋白：融合蛋白（FUS）和α-突触核蛋白（αSyn）。FUS的原始克隆（GST-TEV-FUS）由Aaron Gitler教授提供（Addgene质粒编号29629；http://n2t.net/addgene:29629；RRID: Addgene_29629）。通过融合克隆技术，该克隆被改造为包含GST亲和标签（用于纯化）、TEV切割位点（用于去除GST标签）以及GFP标签（用于荧光可视化）。
FUS的表达与纯化
FUS蛋白难以通过重组方法纯化。为了验证表达宿主细胞是否会影响FUS的纯化效果，我们在BL21(DE3)细胞和Rosetta细胞中诱导了FUS蛋白的表达。与BL21(DE3)细胞相比，Rosetta细胞在IPTG诱导下表现出更明显的FUS过表达现象，且背景蛋白较少（图1a）。过表达的FUS蛋白（理论分子量为108 kDa）位于97 kDa标记带之上。我们采用了两种方法来纯化过表达的FUS蛋白：
结论
对于α-突触核蛋白（αSyn）和FUS这类易聚集的蛋白，L-精氨酸的效应非常显著。在没有L-精氨酸的情况下，我们无法纯化FUS蛋白，因为约95%的FUS蛋白以不溶性形式存在，即使使用高浓度的尿素或盐酸胍也无法使其溶解。在缓冲液中添加L-精氨酸后，获得了几乎纯度的FUS蛋白，纯化产量为每500 ml培养液4.1 mg。同样，α-突触核蛋白的纯化产量也提高了3倍（从0.4 mg提高到……）
CRediT作者贡献声明
H.P. Chethana：撰写初稿、验证数据、方法设计、实验实施、数据分析。U. Rathan Kumar：方法设计、实验实施。Gunimala Chakraborty：审稿与编辑、项目监督、项目管理。Arshdeep Sidhu：撰写与编辑、初稿撰写、数据可视化、项目监督、方法设计、资金申请、数据分析、概念构思。
资助
本研究得到了Nitte（被认定为大学）的资助（项目编号：N/RG/NUFR1/NUCSER/2020/01），资助对象为Arshdeep Sidhu。资助机构未参与研究设计、数据收集与分析、报告撰写或文章发表决策的过程。
