经质粒转化的长双歧杆菌105A菌株能够分泌β-葡萄糖醛酸酶，用于将SN-38葡萄糖醛酸酯转化为前药

《Protein Expression and Purification》：Plasmid-transformed Bifidobacterium longum 105A secreting β-glucuronidase for prodrug conversion of SN-38 glucuronide

本研究通过构建分泌β-葡萄糖苷酶的重组乳酸杆菌，在肿瘤微环境中的厌氧条件下将SN-38G转化为活性代谢物SN-38，实现肿瘤靶向激活，为开发新型化疗系统提供依据。

　　这项研究探讨了一种利用微生物增强前药激活的新策略，以提高癌症治疗的靶向性和安全性。研究人员聚焦于SN-38G（SN-38的葡糖苷酸形式），这是一种高度亲水的前药，具有较低的膜渗透性，因此在未被β-葡糖苷酶水解之前，其药理活性较低。为了实现SN-38G在肿瘤部位的局部激活，他们设计了一种重组的**长双歧杆菌105A**（*Bifidobacterium longum* 105A），该菌株能够分泌β-葡糖苷酶。这一策略基于肿瘤微环境中存在的特定条件，如轻微的酸性环境和缺氧环境，这些条件有助于β-葡糖苷酶的稳定催化活性。通过实验验证，这种微生物系统能够在肿瘤微环境中有效激活SN-38G，将其转化为具有高度细胞毒性的SN-38，从而达到对肿瘤细胞的抑制效果。

癌症治疗的一个核心难题是，如何在有效消灭肿瘤细胞的同时，最大限度地减少对正常组织的损害。传统化疗药物虽然在某些情况下能够有效杀伤癌细胞，但它们通常对快速增殖的正常组织如骨髓和肠道上皮也具有毒性，导致严重的副作用，限制了其临床应用。此外，肿瘤细胞对分子靶向药物的耐药性以及免疫治疗的不完全反应，也凸显了开发具有不同作用机制的多种化疗药物的必要性。同时，需要新的药物递送系统，以实现对强效抗肿瘤化合物的局部激活，从而减少其在全身范围内的暴露，降低毒副作用。

在这一背景下，研究人员提出了利用非致病性厌氧菌作为药物递送载体的思路。长双歧杆菌是一种天然存在于人体肠道中的厌氧菌，能够优先定植在缺氧的实体肿瘤区域。这一特性使得它成为一种理想的肿瘤靶向载体。在之前的研究中，研究人员发现将长双歧杆菌通过静脉注射引入肿瘤模型动物体内后，该菌株能够选择性地定位于肿瘤的微环境中，并在其中增殖。尽管静脉注射细菌在传统观念中被认为存在风险，如引发菌血症或败血症，但研究团队和其他研究者已经证明，使用长双歧杆菌105A进行治疗是安全且合理的，特别是在肿瘤靶向药物递送方面。

作为这一概念的代表性例子，研究团队开发了一种重组菌株APS001F，该菌株表达胞嘧啶脱氨酶（CD），能够将无毒的前药5-氟胞嘧啶（5FC）转化为具有活性的5-氟尿嘧啶（5FU）。这种菌株在一项美国进行的I期临床试验中被证明是安全且可行的。基于这一成功经验，研究人员进一步拓展了这一微生物平台，探索其在另一种化疗药物——**伊立替康**（Irinotecan）的应用。

伊立替康是一种需要酶促激活才能发挥抗肿瘤作用的前药。在体内，伊立替康首先被羧酸酯酶转化为其活性代谢产物SN-38，这是一种强效的拓扑异构酶I抑制剂，其细胞毒性约为伊立替康本身的1000倍。然而，SN-38在肝脏中会被UDP-葡糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）进一步葡糖苷化，形成SN-38G。SN-38G在生理条件下表现出极高的亲水性和离子化特性，因此具有非常低的膜渗透性，难以进入细胞内部。这种特性使得SN-38G在体内保持非活性状态，只有在被β-葡糖苷酶水解后，才能转化为具有更高膜渗透性和活性的SN-38。

基于这一机制，研究人员提出了利用SN-38G的葡糖苷化与脱葡糖苷化过程作为肿瘤靶向前药激活策略。他们设计了一种通过质粒转化的长双歧杆菌菌株，使其能够在肿瘤微环境中分泌β-葡糖苷酶，从而将SN-38G转化为SN-38。考虑到长双歧杆菌的厌氧特性以及其在缺氧肿瘤区域的优先定植能力，这一系统有望在肿瘤微环境中增强SN-38G的局部激活，同时减少其在全身范围内的暴露。这种基于长双歧杆菌的肿瘤靶向前药激活平台，为伊立替康类药物的化疗提供了一种新的思路。

在实验过程中，研究人员首先对β-葡糖苷酶的分泌能力进行了验证。他们发现，重组的长双歧杆菌105A在厌氧条件下，能够有效地将β-葡糖苷酶分泌到培养上清液中。通过His标签亲和层析法对分泌的酶进行纯化，并利用薄层色谱法（TLC）以4-甲基伞形基-β-D（?）-葡糖苷酸（4-MUG）作为底物，验证了该酶的活性。纯化后的酶在结合部分显示出良好的催化活性，且通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）和Western blot分析，研究人员确认了该酶的分子量约为71 kDa，与预测结果一致。这些实验结果表明，重组菌株能够稳定地分泌具有活性的β-葡糖苷酶。

为了进一步验证该策略的可行性，研究人员进行了MTT实验，以评估β-葡糖苷酶与SN-38G共同作用对CT26结肠癌细胞的抑制效果。实验结果显示，当β-葡糖苷酶与SN-38G同时作用时，能够显著抑制CT26细胞的生长，而单独使用SN-38G则未表现出细胞毒性。这表明，在缺乏β-葡糖苷酶的情况下，SN-38G无法被激活，因此无法发挥其抗肿瘤作用。进一步的高效液相色谱（HPLC）分析也确认了SN-38G在培养上清液中被转化为SN-38，这一转化过程依赖于β-葡糖苷酶的存在。

这一结果不仅证明了微生物增强前药激活策略的可行性，还展示了该策略在肿瘤治疗中的潜在应用。通过将长双歧杆菌的天然肿瘤靶向能力与β-葡糖苷酶的催化活性相结合，研究人员构建了一种新的药物激活平台，该平台能够在肿瘤微环境中实现前药的局部激活，从而提高治疗效果并降低全身毒性。这一策略的开发，为未来设计更加精准和安全的肿瘤靶向治疗方案提供了理论依据和技术支持。

此外，研究人员还强调了该策略在实际应用中的优势。首先，由于长双歧杆菌是一种天然存在于人体肠道的益生菌，因此其在体内的定植能力较强，能够有效避免被宿主免疫系统清除。其次，该菌株在厌氧条件下能够稳定分泌β-葡糖苷酶，这使得其在肿瘤微环境中的活性得以维持。最后，该策略能够实现对多种不同作用机制的前药的局部激活，为未来的个性化治疗方案提供了可能性。例如，除了SN-38G之外，其他需要特定酶促激活的前药也可以通过类似的微生物平台进行转化，从而提高其在肿瘤部位的药效。

这一研究还为癌症治疗中的新型药物递送系统提供了启示。传统的化疗药物通常需要全身给药，这可能导致药物在非靶向组织中的广泛分布，增加毒副作用。而通过微生物介导的局部激活策略，可以将药物的活性限制在肿瘤部位，从而提高治疗的安全性和有效性。这一策略的实现，依赖于对微生物特性的深入理解以及对其基因表达和酶分泌能力的精准调控。因此，研究人员在实验过程中对长双歧杆菌的基因工程改造进行了详细研究，以确保其在体内的稳定性和安全性。

综上所述，这项研究展示了一种基于微生物的新型前药激活策略，为癌症治疗提供了一种创新的解决方案。通过将长双歧杆菌的天然肿瘤靶向能力与β-葡糖苷酶的催化活性相结合，研究人员构建了一种能够在肿瘤微环境中实现前药局部激活的系统。这一策略不仅提高了药物的靶向性和有效性，还减少了全身毒性，为未来开发更加精准和安全的肿瘤治疗方案奠定了基础。