抗菌肽AMP-PD的重组表达（以串联八聚体形式）及其体外抗菌活性

《Protein Expression and Purification》：Recombinant expression of antimicrobial peptide AMP-PD as tandem octamer and its antibacterial activity in vitro

抗微生物肽串联表达系统构建及优化研究。采用His6-AMP-PD8重组质粒在E. coli BL21(DE3)中实现八聚体串联表达，通过优化诱导温度35℃、IPTG浓度0.7mmol/L和诱导时间10小时，获得32mg/L融合蛋白，经甲酸切割纯化后得到16mg/L单体肽，抑菌圈直径12.59mm，MIC 45.75μg/mL，MBC 62.53μg/mL。

　　

卢星淼|孙媛|王子怡|金晓珂|张佳宇|卢福平|杨文超|刘福峰

教育部工业发酵微生物学重点实验室，天津，300457，中国

摘要

抗生素的广泛滥用导致了细菌耐药性的增加，对公共卫生构成了严重威胁。抗菌肽（AMPs）因其低耐药性和广谱抗菌活性而成为有前景的替代品。然而，AMPs的低异源表达效率阻碍了其大规模应用。本文开发了一种新型的串联基因重复表达系统，使用重组质粒His₆-AMP-PD₈，该质粒包含八个OM19R重复序列，并通过天冬氨酸（D）和脯氨酸（P）串联连接，以AMP-PD（PVDKPPYLPRPRPIRRPGGRD）作为模型。在E. coli BL21(DE3)中成功实现了融合蛋白的可溶性表达。通过优化表达条件（包括诱导温度、诱导时间和IPTG浓度），提高了重组蛋白的产量。在最佳条件下（35°C、0.7 mmol/L IPTG和10小时诱导时间），重组蛋白的产量约为32 mg/L。随后，将所得蛋白用50%甲酸在55°C下处理24小时进行切割，再通过3 kDa超滤装置分离纯化，获得了16 mg/L的AMP-PD。结果表明，AMP-PD具有显著的抗菌活性，其对E. coli ATCC25922的抑菌圈直径为12.59 mm，最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）分别为45.75 μg/mL和62.53 μg/mL。本研究成功实现了AMP-PD的可溶性表达系统，为其工业生产和广泛应用奠定了基础。

引言

抗生素耐药性和动物源性食品中的残留兽药所带来的全球健康危机加剧了人们对替代治疗剂的探索[[1], [2], [3]]。抗菌肽（AMPs）作为一种含有8-100个氨基酸的短链多肽，因其广谱抗菌活性和良好的安全性而受到关注[4]。作为先天免疫系统的重要组成部分，AMPs通过静电相互作用破坏细菌细胞膜来抵抗病原体感染，并调节免疫和炎症反应[5]。除了对细菌、真菌和病毒的主要抗菌作用外，AMPs还具有抗氧化、免疫调节和内毒素中和特性[6]。它们的选择性细胞毒性主要针对病原体，对正常细胞的毒性很小，显示出作为传统抗生素可行替代品的巨大潜力[7,8]。这些独特特性推动了其在临床治疗、农业养殖和食品安全工程中的应用研究。

AMPs的制备策略主要包括从天然来源提取、化学合成和通过基因工程进行生物合成[9,10]。从天然来源提取的产量低且成本高，而化学合成虽然能获得较高的纯度和精确的序列，但会产生有毒副产物，且不适用于大分子多肽。相比之下，使用重组表达系统的生物方法在成本效益、可扩展性和环境可持续性方面具有优势，尽管其整体性能可能因目标肽和生产条件而异[11]。工程改造的细菌，特别是E. coli和B. subtilis，在AMPs的生物合成中表现出显著优势，包括良好的遗传背景、快速生长能力和适合高密度发酵[12]。基因工程和合成生物学工具的最新进展通过密码子优化[13]、融合标签策略[14]和串联表达[15]提高了AMPs的异源表达效率。然而，降解敏感性、低表达水平以及异源表达过程中的宿主细胞毒性等问题仍限制了其进一步应用[16,17]。同时，AMPs的分子设计和结构优化为高效表达和功能增强提供了新的方法[18]。

OM19R（即VDKPPYLPRPRPIRRPGGR）是一种基于抗菌肽的结构特性和抗菌机制人工设计的序列，具有潜在的抗菌活性[19]。序列中高比例的精氨酸（26%）的正电荷有助于其与细胞膜的结合，而脯氨酸（31%）赋予了AMP更高的结构稳定性。通过优化氨基酸排列，该序列增强了其对革兰氏阴性细菌的特异性抗菌活性，同时避免了传统AMPs的溶血和细胞毒性效应。通过在OM19R的N端添加PEG修饰链，改善了其药代动力学特性和半衰期[20]。此外，还通过优化表达条件提高了OM19R的有效表达和纯化效率。然而，OM19R的抗菌效果仍不如传统抗生素，其结构和表达水平需要进一步改进。

本研究采用串联表达策略来提高OM19R的表达水平。构建了含有八个OM19R重复单元的重组质粒，并通过天冬氨酸（D）和脯氨酸（P）进行连接，在E. coli中进行了异源表达[21]。进一步优化了重组菌株的诱导条件以增加融合蛋白的表达。将融合蛋白分离、酸切割并纯化得到单体AMP-PD，并根据结构特征评估了其抗菌活性。本研究为AMPs的结构优化和分子设计提供了参考，为新型AMPs的工业生产提供了理论基础。

试剂和菌株

表达宿主Escherichia coli BL21 (DE3)、表达质粒pQE-80 L以及野生型E. coli ATCC25922均来自我们实验室的菌株库。融合蛋白AMP-PD₈的序列由北京华大基因科技有限公司（北京）合成。限制性内切酶BamH I、Hind III和DpnI、Solution I DNA连接酶、PrimerSTAR Max DNA聚合酶以及1 kb DNA梯度标记物均购自北京宝瑞生物技术有限公司（北京）。凝胶提取...

AMP-PD串联多聚体的生物信息学分析

串联表达策略常用于提高目标蛋白的表达水平。然而，过多的重复序列可能导致蛋白质错误折叠，增加表达难度。因此，本研究首先通过串联重复OM19R单体并使用DP连接子设计了八聚体抗菌肽AMP-PD₈。使用ExPASy ProtParam进行的初级结构和理化参数分析显示，AMP-PD由21个氨基酸组成...

结论

本研究通过优化核苷酸序列，开发了八聚体串联融合构建物AMP-PD。重组菌株E. coli BL21在IPTG诱导下成功实现了异源表达，并通过SDS-PAGE检测到重组蛋白AMP-PD₈的存在。结果表明，在最佳条件下（35°C、0.7 mmol/L IPTG和10小时诱导时间），可溶性表达蛋白的产量达到了32 mg/L。

CRediT作者贡献声明

卢星淼：撰写——初稿、实验设计、数据分析。孙媛：实验设计、数据管理。王子怡：实验设计。金晓珂：软件开发、方法学研究。张佳宇：方法学研究。卢福平：撰写——审稿与编辑、概念构思。杨文超：撰写——审稿与编辑。刘福峰：撰写——审稿与编辑、资金获取、概念构思。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号：32272269）、天津市自然科学基金（编号：24JCZDJ00380）以及教育部工业发酵微生物学重点实验室项目和中国天津市工业微生物学重点实验室（编号：2024KF04）的支持。

利益冲突声明

所有作者都对本研究做出了重要贡献，并批准了最终稿件版本。作者声明不存在利益冲突。