培养基和发酵过程对重组人粒细胞集落刺激因子（rh-GCSF）重折叠及纯化的影响

《Protein Expression and Purification》：Effect of culture media and fermentation process on the refolding and purification of rh-GCSF

本研究探讨不同培养基（LB、M9、改良M9）及发酵工艺（批培养、fed-batch培养带/不带补料）对重组人粒细胞集落刺激因子（rh-GCSF）包涵体复性及纯化的影响。通过Western blot、尺寸排阻色谱和反相高效液相色谱分析，发现M9培养基fed-batch培养法下rh-GCSF回收率最高、纯度＞90%、内毒素含量最低，为优化生产提供依据。

　　

索玛耶·阿博尔加塞米（Somayeh Abolghasemi）| 法特梅·普雷伊尼（Fatemeh Poureini）| 瓦利奥拉·巴巴埃伊普尔（Valiollah Babaeipour）| 法埃泽·法尔吉（Faezeh Farji）| 穆罕默德·雷扎·莫菲德（Mohammad Reza Mofid）

伊朗德黑兰ACECR罗扬生殖生物医学研究所（Royan Institute for Reproductive Biomedicine）遗传学与生殖生物医学研究中心（Department of Genetics, Reproductive Biomedicine Research Center）

摘要

人粒细胞集落刺激因子（h-GCSF）用于缓解化疗引起的中性粒细胞减少症。由于产量高且培养策略多样，大肠杆菌是最常用的生产h-GCSF的宿主。然而，在大肠杆菌中过度生产h-GCSF时常会导致细胞质中形成包涵体（IBs）。重组h-GCSF（rh-GCSF）作为包涵体产生的情况下，其重新折叠和纯化的效率取决于表达策略、诱导条件及细胞生长环境。本研究探讨了不同培养基和发酵工艺对包涵体重新折叠及rh-GCSF纯化的影响。通过Western blotting、尺寸排阻色谱法和反相高效液相色谱法将纯化样品与Neupogen?和PDgrastim参考标准品进行比较。分析结果显示，所有蛋白质均成功重新折叠，纯化后的纯度超过90%。使用M9培养基进行补料分批培养时，获得了最高的蛋白质回收率和纯度，同时内毒素含量最低。

引言

人粒细胞集落刺激因子（h-GCSF）是一种生物制药化合物，作为造血细胞因子，在粒细胞（包括中性粒细胞）的增殖、刺激、成熟、激活和动员过程中起着关键作用[1,2]。1991年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了该蛋白（商品名Filgrastim）用于治疗化疗引起的中性粒细胞减少症[3]。h-GCSF是一种糖蛋白，由骨髓间质细胞在粒细胞生成过程中自然产生。由于需求量大，该蛋白主要通过多种宿主（尤其是大肠杆菌）进行重组生产。

重组人粒细胞集落刺激因子（rh-GCSF）在大肠杆菌中主要以包涵体（IBs）的形式表达。因此，获得具有生物活性的rh-GCSF需要额外的步骤，如蛋白质变性及重新折叠[4]。重组蛋白生产的主要目标是获得高纯度样品。这些蛋白的成功应用依赖于有效的下游处理工艺[5]。因此，除了成功生产重组蛋白外，受宿主菌株和诱导剂等因素影响的纯化过程对最终产品的质量至关重要[6]。因此，纯化策略必须从分子层面开始精心设计。

重组蛋白的常见杂质可能来源于分离和纯化方法（如宿主污染物）或培养基[6]。通常，蛋白质通过一系列操作（分离、溶解、重新折叠和纯化）从包涵体中回收，这些过程已在许多研究中得到验证[7]。蛋白质纯化方法多种多样，取决于蛋白质类型、表达位置、溶解度等参数[8]。因此，合适的纯化条件选择需根据具体参数来确定[8]。尽管基因操作和菌株改变会影响包涵体的形成，但其他因素（如培养基及其条件）也会影响包涵体质量，进而影响蛋白质纯度[9]。实际上，调整培养基成分更为简便且经济可行；此外，向培养基中添加辅因子或人工基团有助于蛋白质的正确折叠和溶解度提升[10,11]。因此，不同的培养基（如LB、M9、2 YT和TB）会影响包涵体的结构，进而影响蛋白质的纯度[12]。发酵工艺类型也会通过影响蛋白质表达速率和量以及包涵体质量来影响蛋白质纯化效率[12, [13], [14]]。

尽管已有大量研究关注rh-GCSF的纯化及其纯化条件的优化，但不同培养基和发酵条件对蛋白质纯化的影响尚未得到充分研究。本研究探讨了不同培养基和发酵工艺对重组大肠杆菌表达的rh-GCSF纯化率的影响。首先，在相同操作条件下，分别在LB、M9及改良M9培养基中分批和补料分批培养重组大肠杆菌以生产rh-GCSF。随后收集并裂解表达的细胞，通过离心分离包涵体，进行蛋白质提取和pH值调节以实现蛋白质纯化。最后，利用多种生化及生物物理技术（尺寸排阻色谱、反相高效液相色谱和圆二色光谱）比较了不同培养基和发酵工艺所得的纯化蛋白。同时，通过内毒素检测评估了所有纯化蛋白的生物活性。

材料

所有化学品（包括异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）、甘氨酸、β-巯基乙醇、硫酸铵等）及Triton X-100均购自德国达姆施塔特的Merck公司。无水乙醇、乙酸和盐酸购自伊朗德黑兰的Dr. Mojallali Chemical Laboratories公司。牛血清白蛋白（BSA）来自美国新泽西州皮斯卡特韦的Pharmacia LKB Biotechnology公司。DEAE-Toyopearl由瑞典乌普萨拉的Pharmacia Biotech公司制备。

细菌菌株和质粒

在本研究中...

培养基和发酵工艺对rh-GCSF生产的影响

大肠杆菌的分批培养因其操作简便、管理容易且污染风险低而广泛应用于大规模发酵[20]。培养条件为含有10 g/L葡萄糖和0.2 mM IPTG的LB培养基，OD₆₀₀ = 4.5（相当于2.2 g/L DCW），持续至培养基OD₆₀₀不变（细胞生长停止）。LB（Luria-Bertani）液体培养基是常用的重组蛋白表达培养基。

结论

本研究全面比较了不同培养基（LB、M9及改良M9）和发酵方法（分批及补料分批培养，有无补料）对重组rh-GCSF纯化过程、纯度和回收率的影响。所有纯化蛋白的纯度均超过90%。观察到，在补料分批培养条件下，高细胞密度可提高蛋白质表达量，但同时也会降低...

作者贡献声明

索玛耶·阿博尔加塞米（Somayeh Abolghasemi）：数据可视化、方法学设计、实验实施、数据整理。 法特梅·普雷伊尼（Fatemeh Poureini）：初稿撰写、软件使用、数据分析。 瓦利奥拉·巴巴埃伊普尔（Valiollah Babaeipour）：修订与编辑、项目监督、方法学设计、资金获取、数据分析、概念构思。 法埃泽·法尔吉（Faezeh Farji）：方法学设计、实验实施、数据整理。 穆罕默德·雷扎·莫菲德（Mohammad Reza Mofid）：数据可视化、结果验证、软件使用、方法学设计、概念构思。

发表同意

所有作者均同意发表本文。

伦理批准

本声明“不适用”。

数据和材料的可用性

作者声明本研究的数据支持结果已发表于文章中。如需其他格式的原始数据文件，可向通讯作者提出合理请求。

资金支持

本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织的任何资助。

利益冲突

作者无需要披露的相关财务或非财务利益。