人类乙型肝炎病毒中HBx蛋白的一种与癌症相关的异构体的表达、纯化及功能验证

《Protein Expression and Purification》：Expression, purification and functional validation of a cancer-associated isoform of the HBx protein from human hepatitis B virus

重组表达与纯化HBx1-120蛋白的实验方法及结构功能验证。通过包涵体溶解、离子交换层析和尺寸排阻层析获得高纯度未标记的HBx1-120，结合质谱和核磁共振技术表征其结构特性，并通过泛素结合实验验证其与Spindlin1的功能互作。

　　在人类中，乙型肝炎病毒（HBV）是一种具有广泛影响的病原体，它引起的肝炎B疾病可能表现为急性和慢性感染。其中，HBV编码的四种蛋白质中，X蛋白（HBx）在病毒复制过程中扮演着至关重要的角色。特别是在慢性HBV感染中，病毒DNA会整合到宿主基因组中，此时HBx的某个截断形式，即HBx1-120，因其在宿主细胞中的高表达而备受关注。该截断形式具有约12.85 kDa的分子量，是研究HBV如何在慢性感染中导致肝癌（HCC）机制的关键。由于HBx在体外研究中表现出高度聚集倾向，因此开发一种能够有效表达和纯化未标记HBx1-120的方法对于深入了解其结构和功能特性具有重要意义。

本研究提出了一种新的实验方案，旨在从大肠杆菌中分离并纯化未标记的HBx1-120。这一过程包括细胞裂解、从包涵体（IBs）中回收蛋白质、在尿素溶液中溶解蛋白质，以及通过离子交换（IEX）和凝胶过滤（SEC）等方法逐步纯化。此外，该方法还兼容稳定的同位素标记，使得研究人员可以在最小培养基中对蛋白质进行标记，从而进一步利用核磁共振（NMR）等技术分析其结构特性。最终获得的HBx1-120不仅具有高纯度，还能够在功能实验中与已知的相互作用蛋白Spindlin1结合，验证了其活性。

为了实现这一目标，研究人员首先利用特定的质粒载体构建了HBx1-120的表达系统。通过限制性酶切和PCR扩增技术，将HBx1-120的基因序列插入到pET-28a (+)载体中，去除了原本存在的组氨酸标签，以确保蛋白质在纯化过程中不会受到标签的影响。随后，将该载体转化到大肠杆菌BL21 (DE3)细胞中，并在特定条件下进行表达诱导。在表达完成后，细胞被裂解，蛋白质被回收至包涵体中，并在尿素溶液中溶解，以提高其溶解度。接着，通过离子交换色谱和凝胶过滤色谱等步骤，逐步去除杂质，最终获得高纯度的HBx1-120。

在纯化过程中，研究人员还特别关注了尿素对蛋白质结构的影响。尿素作为一种变性剂，会破坏蛋白质的天然结构，使其进入一种展开的状态。这种展开状态虽然影响了蛋白质的分子量测定，但同时也为后续的NMR分析提供了条件。通过两步透析，研究人员能够逐步降低尿素的浓度，使蛋白质恢复到更接近天然状态的缓冲液环境中。这一过程不仅提高了蛋白质的纯度，还保留了其与Spindlin1的结合能力，从而验证了HBx1-120在体外的功能活性。

在实验过程中，研究人员还采用了多种分析手段来评估HBx1-120的纯度和完整性。例如，通过紫外-可见光谱（UV/Vis）分析，研究人员可以计算蛋白质的浓度，并通过A260/A280比值判断是否存在DNA污染。此外，质谱分析（ESI-MS）的结果显示，HBx1-120在经过透析后仍然保持高纯度，并且未出现明显的降解或异常修饰。通过比较不同条件下的质量分布，研究人员确认了HBx1-120的分子量及其可能的修饰情况，进一步支持了其作为研究对象的可靠性。

为了进一步验证HBx1-120的结构特性，研究人员还进行了NMR实验。在高尿素浓度下，HBx1-120表现出较低的信号分散，表明其主要处于无规卷曲状态，缺乏稳定的二级结构。然而，当尿素浓度降低至接近天然条件时，NMR数据仍然显示蛋白质具有良好的折叠能力，并且能够与Spindlin1形成稳定的复合物。这一结果表明，HBx1-120虽然在天然状态下可能表现为无序蛋白，但在特定的缓冲液环境中仍然能够保持其功能性。

值得注意的是，尽管HBx1-120在体外实验中表现出高度聚集倾向，但在本研究中，通过从包涵体中回收并逐步溶解的方法，研究人员成功地获得了具有功能活性的蛋白质。此外，通过与Spindlin1的结合实验，进一步验证了HBx1-120在体外环境中的活性。Spindlin1是一种转录共激活因子，能够识别组蛋白尾部的翻译后修饰，因此其与HBx1-120的相互作用对于理解HBV如何影响宿主细胞的基因表达具有重要意义。

该实验方法不仅在纯化过程中具有较高的效率，还能够适应不同研究需求。例如，对于需要高浓度蛋白质的研究，研究人员可以通过调整透析步骤和浓缩条件来满足要求；而对于需要更接近天然状态的蛋白质，则可以通过逐步降低尿素浓度和增加L-精氨酸的浓度来实现。此外，该方法还支持同位素标记，使得研究人员能够在NMR实验中获取更精确的蛋白质结构信息。这些优势使得该方法成为研究HBx1-120的理想选择。

在实验过程中，研究人员还发现，HBx1-120在SDS-PAGE电泳中常表现为二聚体形式，这可能与蛋白质本身的结构特性有关。尽管在纯化过程中采用了还原条件，并在SDS-PAGE的上样缓冲液中加入了还原剂，但二聚体的形成仍然存在。通过Western blot分析，研究人员确认了这些带的来源，并进一步表明HBx1-120在天然状态下可能以二聚体形式存在。这一发现为理解HBx1-120在细胞内的行为提供了新的视角。

总体而言，本研究提出了一种高效且可靠的实验方案，用于从大肠杆菌中表达和纯化未标记的HBx1-120。通过优化溶剂条件和透析步骤，研究人员不仅克服了蛋白质聚集的问题，还保留了其与Spindlin1的结合能力，为后续的结构和功能研究奠定了基础。此外，该方法还支持同位素标记，使得研究人员能够更深入地探索HBx1-120的分子机制。这些成果对于揭示HBV如何在慢性感染中导致肝癌的发生机制具有重要意义，也为相关疾病的治疗和预防提供了新的思路和方向。